نهج مبسط للبروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي باستخدام مناطق أنسجة مختارة

لقد طورنا طريقة مبسطة لدراسة البروتين في مناطق معينة من عينات الأنسجة العليا باستخدام قياس الطيف الكتلي. هدفنا هو تعزيز تقنية البروتينات ، بما في ذلك تحضير العينات وتحليل قياس الطيف الكتلي ، لتحقيق دقة وموثوقية عالية. يتمثل أحد التحديات في البروتينات المكانية القائمة على FFPE في الهضم غير الكامل للبروتين ، مما يقلل من التغطية الإجمالية للبروتين.

يتطلب التغلب على هذه بروتوكولات الهضم المحسنة واستراتيجيات قياس الطيف الكتلي المحسنة لتحسين أعماق البروتين ودقته. حددنا تغيرات بروتينية مميزة عبر أنواع مختلفة من أمراض البنكرياس ، مما يوفر نظرة ثاقبة للاختلافات بين الحالات الحميدة ومحتملة التسرطن. يمكن أن تساعد هذه النتائج في التشخيص المبكر لسرطان البنكرياس.

نحن نهدف إلى تطوير طريقة بروتيناز المريض لتحقيق رسم خرائط بروتين عالي الدقة داخل مناطق الأنسجة. باستخدام البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي ، نسعى إلى تحديد التوقيعات الجزيئية الخاصة بالمنطقة التي تساهم في اكتشاف المؤشرات الحيوية. يدمج نهجنا زخارف المرضى والتحضير المسبق مع قياس الطيف الكتلي للمناسبات المستقلة عن البيانات لتوليد بيانات بروتيوم عالية الجودة بسرعة من مناطق أنسجة FFPE المختارة.

تتيح هذه الطريقة تقديرا كميا كبيرا للبروتين المكاني. للبدء ، قم بإعداد شريحة أنسجة ملطخة بالهيماتوكسيلين واليوزين أو ملطخة بالمواد الكيميائية المناعية مع منطقة الاهتمام التي يشير إليها أخصائي علم الأمراض. ضع شريحة الأنسجة غير الملوثة وتنزلق الأنسجة الملطخة من الخلف إلى الخلف ، مما يضمن المحاذاة المناسبة.

باستخدام مشرط ، قم بإزالة مناطق الأنسجة غير المهمة وكشط مناطق الأنسجة ذات الأهمية باتجاه مركز الشريحة. انقل الأنسجة المجمعة إلى أنبوب ربط نظيف منخفض البروتين سعة 1.5 مل وأضف 180 ميكرولترا من محلول تحلل SDS إلى كل أنبوب. أداء سونيكاشن التحقيق في 20٪ السعة لمدة 10 دورات من خمس ثوان وخمس ثوان.

الآن ، احتضان العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 3.5 ساعة مع الحفاظ على سرعة 1 ، 000 جم ، بعد الحضانة ، اترك العينة تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم ، جهاز الطرد المركزي عند 16،000 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لفصل بقايا الأنسجة عن المادة الطافية. اجمع المادة الطافية في أنبوب نظيف ومسمى وخزنها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام الآخر.

لترسيب الأسيتون ، ضع عينة البروتين المقابلة ل 100 إلى 300 ميكروغرام في أنبوب متوافق مع الأسيتون. ثم أضف الأسيتون المثلج ، المبرد مسبقا إلى 20 درجة مئوية تحت الصفر ، بحجم خمسة أضعاف حجم العينة. احتضان الخليط على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 18 ساعة.

بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 16 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة. تخلص بعناية من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات البروتين. أضف 500 ميكرولتر من الأسيتون المخفف عند 20 درجة مئوية تحت الصفر وأجهزة الطرد المركزي.

بعد صب المادة الطافية ، جفف العينة بالهواء. قم بإعداد المخزن المؤقت لتحلل محاصرة التعليق في الماء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت المحضر إلى أنبوب العينة والدوامة جيدا لإذابة حبيبات البروتين المجففة بالهواء.

ضع العينة في حاضنة رج على حرارة 100 درجة مئوية عند 1,000 جم لمدة 35 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من الكاشف المؤلكل إلى العينة واحتضان العينة في درجة حرارة الغرفة عند 300 جم لمدة ساعة واحدة. داخل غطاء الدخان الكيميائي ، أضف خمسة ميكرولترات من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك 10٪ إلى العينة ، مما يجعل الحجم الإجمالي 55 ميكرولترا.

تحقق من الرقم الهيدروجيني للعينة باستخدام ورق الأس الهيدروجيني للتأكد من أنها أقل من واحد. بعد ذلك ، أضف 350 ميكرولترا من المخزن المؤقت الملزم إلى العينة لاحتجاز البروتينات. ضع عمود التعليق في أنبوب سعة ملليلتر وانقل العينة بأكملها ، بما في ذلك أي مادة غير قابلة للذوبان ، إلى العمود.

الطرد المركزي العمود عند 4 ، 000 جم لمدة 50 ثانية لاحتجاز البروتينات. ثم أضف 400 ميكرولتر من مخزن الغسيل الثاني. بعد الطرد المركزي ، تخلص من التدفق.

بعد الغسيل النهائي ، قم بالطرد المركزي للعمود عند 4 ، 000 جم لمدة 1.25 دقيقة لضمان المرور الكامل للمخزن المؤقت الأول. أضف 125 ميكرولترا من المخزن المؤقت للهضم إلى عمود محاصرة التعليق وقم بتغطيته لمنع التبخر. احتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة دون اهتزاز.

الآن ، أضف 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف إلى عمود محاصرة التعليق وجهاز الطرد المركزي عند 4 ، 000 جم لمدة 1.25 دقيقة. اسحب الببتيدات المملوءة وانقلها إلى أنبوب جديد نظيف. بعد القياس الكمي للببتيد ، قم بتجميد 20 ميكروغراما من الببتيدات.

إعادة إذابة الببتيدات المجففة بالتجميد في 40 ميكرولتر من العازلة المائية التي تحتوي على 3٪ أسيتونيتريل في 0.1٪ من ماء حمض الفورميك والصوتنة لمدة 10 دقائق في حمام صوتنة. قم بالطرد المركزي للعينة عند 16 ، 000 جم لمدة 60 دقيقة ونقل المادة الطافية إلى قوارير لتحليل قياس الطيف الكتلي. قم بحقن ميكرولترين من كل عينة باستخدام جهاز أخذ العينات الآلي لنظام قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا النانوية السائلة.

الببتيدات المنفصلة على عمود الطور المعكوس معبأ بثلاثة ميكرومترات C18 مادة باستخدام تدرج 127 دقيقة من خمسة إلى 35٪ أسيتونيتريل بمعدل 100 نانولتر في الدقيقة. تأين الببتيدات عبر مصدر أيون الرش النانوي ونقلها إلى مطياف الكتلة القائم على Orbitrap. تحليل الببتيدات باستخدام طريقة اكتساب ضيقة المدى مستقلة عن البيانات.

تم تحقيق عزل دقيق لمنطقة الاهتمام أثناء معالجة أنسجة FFPE عبر أنسجة مختلفة من البارافين الكيسي الثابت بالفورمالين في البنكرياس. تم الحصول على كروماتوغرامات الأيونات الكلية القابلة للتكرار بين التكرارات البيولوجية الثلاثية لكل نوع من أنواع الأورام الكيسية البنكرياسية. حدد تحليل الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة 9،703 بروتين.

امتدت وفرة جميع البروتينات المحددة إلى 6.25 ترتيب من حيث الحجم ، مما يدل على تغطية شاملة للبروتين ، وتم تحديد علامات بروتين سرطان البنكرياس المعروفة. تم تحديد ما مجموعه 933 بروتينا معبرا عنه تفاضليا ، مع 457 بروتينا تم تنظيمه بشكل مخفض و 476 في الأورام المخاطية الحليمية داخل القناة. كشف تحليل المعلوماتية الحيوية أن البروتينات المعبر عنها بشكل تفاضلي كانت مرتبطة بالعديد من المسارات المتعلقة بسرطان البنكرياس.