توليد وتوصيف الخلايا النجمية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان والتي تفتقر إلى البروتين النووي الريبي X messenger الهش

يركز هذا العمل على أربع خلايا نجمية بشرية خاصة بالدماغ وكيف يتم تغييرها بسبب اضطرابات النمو العصبي مثل متلازمة X الهشة. استخدم العمل السابق نماذج حيوانية لدراسة الخلايا العصبية في الغالب ، لذلك يضيف هذا العمل بعدا جديدا لهذا المجال من البحث.

حققت الرؤى الميكانيكية من الدراسات التي أجريت على نجاحا سريريا محدودا. التحدي الرئيسي هو اكتساب رؤى مماثلة في الخلايا العصبية والخلايا النجمية من أصل بشري.

نجح بروتوكولنا في إنشاء وظيفية للخلايا النجمية الخاصة بالرياح ، والتي تظهر استقلاب غير منظم ، وتحلل السكر ، والميتوكوندريا في متلازمة X الهشة ، مما يتيح إجراء تحقيقات في دور الخلايا الدبقية في بيولوجيا المرض. على الرغم من الأدلة المتزايدة على الدور الرئيسي للخلايا الدبقية في وظيفة الخلايا العصبية في الصحة والمرض ، لا يعرف سوى القليل عن كيفية تأثر الخلايا النجمية البشرية في اضطرابات النمو العصبي ، مثل متلازمة X الهشة.

بالنظر إلى المستقبل ، سنبني على هذا الإطار لدراسة كيفية تغيير الخلايا النجمية وتفاعلاتها مع الخلايا العصبية بسبب المرض ، ثم كيف يمكن تصحيحها عن طريق التدخلات العلاجية.

[مدرب] للبدء ، قم بتغطية طبق من ستة انتفاخات ب Matrigel المخفف بنسبة واحد إلى 60 في DMMF 12 المتقدم. قم بتخزين الطبق المطلي عند درجة حرارة من درجتين إلى ثماني درجات مئوية. في يوم الزراعة ، قم بإزالة مادة الطلاء من الطبق وأضف ملليلترا واحدا من ثمانية وسط أساسي كامل ، جنبا إلى جنب مع مثبط الصخور بتركيز نهائي يبلغ X واحد. ضع الطبق داخل حاضنة. تضبط على 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون قبل إضافة الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ، أو IPSCs. قم بزرع IPSCs البشرية في وسط أساسي كامل مع مثبط الصخور بتركيز نهائي من X واحد لتعزيز التصاق المستعمرة. في اليوم التالي ، استبدل الوسط الثمانية الأساسي الكامل بوسط جديد ، يفتقر إلى مثبط الصخور. استمر في تجديد الوسط يوميا حتى تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء ، الأمر الذي يستغرق حوالي أربعة إلى خمسة أيام. عندما تصل المستعمرات إلى 80٪ من التقاء ، أضف مزيجا من الكولاجيناز والتباعد لفصلها إنزيميا عن الطبق. بمجرد أن تبدأ المستعمرات في الرفع ، أخرج الطبق من الحاضنة وأضف ملليلترين من DPBS لتحييد نشاط الإنزيم. باستخدام DPBS ، اكشط المستعمرات واجمع المعلق في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، باستخدام ماصة مصلية عريضة سعة 10 ملليلتر. بعد ذلك ، باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مليلتر ، قم بتقطيع المعلق برفق مرتين إلى ثلاث مرات لتفكيك المستعمرات. اسمح للمستعمرات بالاستقرار. بعد دقيقتين تقريبا ، قم بشفط خليط إنزيم DPBS مع ترك ما يقرب من ملليلتر واحد من السائل في الأنبوب. ثم أضف ملليلترين من DPBS إلى الأنبوب واخلطه عن طريق النقر برفق لإعادة تعليق المستعمرات. اسمح لهم بالاستقرار ، وكرر هذه العملية مرتين لإزالة الإنزيم المتبقي. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق المستعمرات في مليلتر واحد من ثمانية متوسطات أساسية كاملة ووضعها في طبق مطلي ب Matrigel طازج. ترفع الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان إنزيميا كما هو موضح سابقا. ضعها في طبق ثقافة معلق غير ملتصق مقاس 100 ملم بوسط محدد كيميائيا. ضع معلق الخلية على شاكر مداري بمعدل 40 دورة في الدقيقة لمدة سبعة أيام في ظل ظروف طبيعية لتسهيل تطور كرات الكورتيكو. في اليوم الثامن ، انقل كرات الكورتيكو إلى وسط تكاثر الخلايا واحتفظ بها لمدة سبعة أيام. للحث على المواصفات الدبقية ، احتضان كرات الكورتيكو في وسط تخصيب الدبقي لمدة أسبوعين للحصول على كرات دبقية مبكرة. لنضج الكرات الدبقية المبكرة ، استبدل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي H ب 20 نانوغرام لكل مليلتر من العامل المثبط لسرطان الدم ، وحافظ على الكرات لمدة أربعة أسابيع.

بعد أربعة أسابيع في وسط النضج ، استمر في الحفاظ على الكرات في وسط التخصيب الدبقي لفترات طويلة. لمنع التراكم وفقدان الجدوى ، قم بتقطيع الكرات الدبقية ميكانيكيا كل أسبوعين باستخدام شفرة صناعية معقمة. استبدل الوسط بأكمله ب DNase واحد لإزالة شظايا الحمض النووي المتولدة عن التقطيع. بعد ذلك ، قم بفصل الكرات الدبقية إلى طبقات أحادية من الخلايا السلفية للخلايا النجمية ، باستخدام مجموعة تفكك غراء. ضع الخلايا المنفصلة على مزرعة خلوية ، طبق ملتصق معالج مغطى مسبقا ب Matrigel عند تخفيف من واحد إلى 80. نشر الخلايا السلفية للخلايا النجمية في وسط تخصيب الخلايا الدبقية حتى تصل إلى 80٪ من التقاء. الممر الخلايا يزيل الوسط المستهلك ويجمعه في أنبوب مخروطي الشكل. أضف وسط انفصال خلايا الإنزيم إلى الخلايا وانتظر لمدة دقيقة إلى دقيقتين. بمجرد أن تبدأ الخلايا في الانفصال ، أضف الوسط المستهلك لتحييد نشاط الإنزيم. اجمع تعليق الخلية وجهاز الطرد المركزي عند 800 جم لمدة دقيقتين. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في وسط التخصيب الدبقي. ضع صفيحة واحدة في 10 تقريبا إلى قوة ست خلايا لكل بئر على طبق مطلي ب Matrigel عند تخفيف من واحد إلى 80. للحفظ بالتبريد ، أعد تعليق حبيبات الخلية في خليط بارد من 90٪ وسط تكاثر كرة الكورتيكو و 10٪ من مادة التكاثر بالتبريد. انقل الخلايا المعاد تعليقها إلى قوارير تبريد. انقل قوارير التبريد على الفور إلى صندوق التبريد واحفظها في الفريزر عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل. في اليوم التالي ، انقل جميع قوارير التبريد إلى خزان النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل. قم بتمييز الخلايا السلفية للخلايا النجمية المنفصلة عن طريق التلوين المناعي باستخدام علامات Vimenton وعامل IAM النووي. لتأكيد الخصوصية الإقليمية الأربعة للدماغ لناقلات الجنود المدرعة المشتقة من IPSC البشرية ، قم بإجراء تحليل QPCR في الوقت الفعلي لصندوق رأس الشوكة البشرية G1 وصندوق الهوميو البشري ، B4. قم بتمييز APCs إلى الخلايا النجمية ووسط التمايز النجمي لمدة 14 يوما. صفيحة الخلايا النجمية على طبق زجاجي قاع 35 ملم بكثافة خمسة في 10 أس ثلاث خلايا لكل طبق لقياس استجابتها للأدينوزين خمسة ثلاثي الفوسفات. اسمح للخلايا بالالتصاق بالقاع الزجاجي لمدة 24 ساعة. اغسل الخلايا الملتصقة ثلاث مرات بمحلول الملح المتوازن من هانك بدون الكالسيوم. ثم احتضان الخلايا في وسط الاستزراع الذي يحتوي على خمسة مدريد متري بنسبة ميكرومولار 2:00 صباحا ، و 0.02٪ الفلورون F127 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الخلايا مرتين بوسط الاستزراع ، استبدل الوسط بمللي مولار من الكالسيوم يحتوي على محلول هانك المتوازن للملح. قم بتصوير الخلايا بإطارين في الثانية ، باستخدام هدف الغمر بالزيت 60X على مجهر مقلوب يعوض الانجراف المركز. أخيرا ، سجل استجابات الكالسيوم المستحثة ATP بعد إضافة ATP بتركيز نهائي قدره خمسة مللي مولار عند علامة 25 ثانية. عبرت مستعمرات IPSC البشرية عن علامات متعددة القدرات تختار أربعة ونانو كما يؤكده التلوين المناعي. أظهرت APCs المشتقة من متلازمة X الهشة وخطوط التحكم نسبا مماثلة من الخلايا الإيجابية vimentin و NFIA. أظهرت الخلايا السلفية للخلايا النجمية من كل من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ومتلازمة X الهشة تنظيما أعلى ل Fox G1 ، مقارنة ب HOXB4 ، مما يشير إلى هوية الدماغ الأمامي. أظهرت الخلايا النجمية المشتقة من خطوط متلازمة X الهشة IPSC البشرية عددا منخفضا من تعبير GFAP. أظهرت الخلايا النجمية المتحكمة والهشة متلازمة X عابرة من الكالسيوم الناجم عن ATP ، لكن عدد المستجيبين كان أقل بكثير في الخلايا النجمية لمتلازمة X الهشة. كانت ذروة سعة أول عابر من الكالسيوم الذي يستثاره ATP أقل بكثير في الخلايا النجمية المتلازمة X الهشة مقارنة بالخلايا الضابطة. أظهرت الخلايا النجمية المتلازمة X الهشة المشتقة من IPSC البشرية زيادة في تحلل السكر ، والقدرة على تحلل السكر ، واحتياطيات الحالة للسكر ، ولكنها أظهرت انخفاضا كبيرا في التنفس الأقصى مقارنة بالخلايا النجمية المتحكمة.