مراقبة الديناميكيات التوافقية للبروتينات المفردة غير المعدلة باستخدام نساقطات النوتوزان البلازمونية
مارس 21, 2025
تستخدم المثقلة النانوية البلازمونية رنين البلازمون السطحي الموضعي في الهياكل النانوية الذهبية لاحتجاز الجسيمات النانوية المفردة ، بما في ذلك البروتينات ، داخل مجال بصري بمقياس نانومتر. تكشف التغييرات في الإشارة المتناثرة عن وجود البروتين والديناميكيات التوافقية ، مما يتيح المراقبة دون تعديلات الفلوروفور أو الربط السطحي.
يهدف هذا البحث إلى اكتساب نظرة ثاقبة للبروتينات الخالية من الملصقات على مستوى الجزيء الفردي في الوقت الفعلي ، مع التركيز بشكل خاص على البروتينات التي يصعب التحقيق فيها باستخدام التقنيات الحالية أو لها صلة بالأمراض. أثبتت اللوثان النانوي البلازموني مؤخرا قدرتها على مراقبة الديناميكيات التوافقية عند الارتباط بجزيئات صغيرة ، والتحقق من حركية التفكيك ، وتوضيح المناظر الطبيعية للطاقة الحرة ، كل ذلك على مستوى الجزيء الواحد. حاليا ، لا توجد تقنية توصيف بروتين راسخة قادرة على التحقيق في ديناميكيات تركيب البروتين أحادي الجزيء الخالية من الملصقات.
يعتقد أن الناسق البلازموني لديه القدرة على ملء هذا المكان في هذا المجال. تساعدنا هذه الميزة الفريدة على التحقيق في العلاقة بين التغيير التوافقي للبروتينات ووظائفها البيولوجية والآثار المترتبة على تطور المرض. ستركز الأبحاث المستقبلية على البروتينات المضطربة جوهريا والبروتينات الغشائية ، حيث أن العديد منها متورط في العديد من الأمراض مثل مرض الزهايمر وباركنسون وأنواع مختلفة من السرطان.
للبدء ، ضع العينة المطلية ب PEG-thiol في خلية التدفق المطبوعة ثلاثية الأبعاد باستخدام ملاقط مستقيمة ، مما يضمن أن الطبقة الذهبية متجهة لأعلى. انزع جانبا واحدا من غطاء الشريط البلاستيكي الشفاف على الوجهين PET. ضع الشريط بعناية فوق العينة وخلية التدفق ، مع التأكد من بقاء الهياكل النانوية وفتحات السحب / السحب في خلية التدفق مكشوفة.
باستخدام ملاقط مستديرة ، اضغط برفق حول حواف الشريط لتأمين التصاقه بخلية التدفق والعينة. انزع الجانب الآخر من الشريط وضع غطاء زجاجي برفق فوق العينة. استخدم ملاقط مستديرة للضغط حول حواف زلة الغطاء لتأمين التصاقها.
تخلق هذه العملية قناة سائلة داخل خلية التدفق بارتفاع 50 ميكرومتر وحجم 3.5 ميكرولتر. باستخدام طرف ماصة صغير، امزج أجزاء متساوية من المحلول A والمحلول B من السيليكون المكرر على شريحة مجهرية بنسبة واحد إلى واحد أو يتم تحديدها من قبل الشركة المصنعة. املأ الفجوات بين انزلاق الغطاء وخلية التدفق بسيليكون مزدوج مختلط ، وادفعه برفق أسفل زلة الغطاء.
أمسك خلية التدفق رأسا على عقب وقم بتطبيق السيليكون المكرر بعناية حول الجدار الداخلي للفتحة. حرك السيليكون برفق على الحواف المرئية للجانب السفلي من السيليكا المنصهرة من العينة ، واترك العينة لتجف مع توجيه الطبقة الذهبية لأعلى حتى يتم ضبط السيليكون المكرر بالكامل. بعد التحقق من توصيل جميع المكونات بشكل صحيح ، قم بتحميل واجهة مستخدم نظام الموائع الدقيقة على الكمبيوتر.
انقر فوق أيقونة التشغيل بجوار موزع MUX والسلك ، اللذين يتحكمان في الصمام الدوار 12 × واحد والصمام ثلاثي في اتجاهين على التوالي لفتح الواجهات المقابلة لهما. لتجاوز الصمام ثلاثي في اتجاهين ، قم بتشغيل المنفذ الأول من السلك. لتركيب خلية التدفق في نسقط البلازموني ، قم بتوصيل أنابيب المدخل والمخرج بالأجزاء المناسبة من خلية التدفق.
ضع خلية التدفق على منديل نظيف بحيث تكون الطبقة الذهبية متجهة لأعلى. قم ببث المخزن المؤقت في خلية التدفق بمعدل تدفق عال يبلغ حوالي 0.3 مل في الدقيقة. تأكد من أن السائل يتحرك عبر العينة داخل خلية التدفق وأنه لا يوجد سائل مرئي على الجانب الخارجي أو السفلي.
ضع قطرة أو قطرتين من زيت الغمر على هدف 100X. ضع خلية التدفق في مرحلة النساقط البلازموني مع توجيه الطبقة الذهبية لأسفل. قم بتأمين خلية التدفق باستخدام مشابك معدنية فوق المغناطيس وقفل المسرح لإبقائها في مكانها.
قم بتشغيل مصدر الضوء الأبيض. افتح برنامج الكاميرا واضبط وقت التعرض والكسب حتى تصبح هياكل النانو مرئية. قم بتشغيل الليزر بطاقة عالية نسبيا واضبط المحور Z يدويا حتى تظهر بقعة الليزر.
قم بتشغيل وحدة التحكم الكهروإجهادية وحدد الإعدادات المناسبة لمنفذ الاتصال والحد الأقصى للجهد. اضبط قيم المحور X و Y و Z على نصف الحد الأقصى للجهد للسماح بمحاذاة أفضل للمرحلة في جميع الاتجاهات. قم بمحاذاة بقعة الليزر مع أحد ثقب النانو المزدوج أو هياكل DNH باستخدام مقابض التحكم في المحور الرئيسي X و Y و Z.
تأكد من تشغيل الصمام الثنائي لصور الانهيار الجليدي أو APD. أغلق العلبة برفق على الملقط البلازموني. افتح البرنامج المرتبط بتسجيل APD، مثل واجهة مستخدم LabVIEW محلية الصنع. قم بتحرير اسم الملف وتعيين تردد القطع إلى كيلو هرتز واحد.
ثم حدد مسار الملف المطلوب حيث سيتم حفظ الملفات. قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء الأبيض وإعادة تشغيل الليزر. بعد ضبط طاقة الليزر على مستوى مناسب ، استخدم عناصر التحكم الكهروإجهادية لضبط المحاور X و Y و Z حتى تصبح إشارة APD عالية قدر الإمكان.
تجنب تشبع APD وبأقل انحراف معياري للتتبع. بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل الليزر للحفاظ على عمر الهياكل النانوية. قم بتشغيل وحدة التحكم في مضخة الحقنة وواجهة مستخدم الموزع لضبط الصمام وسحب الكمية المطلوبة من البروتين.
باستخدام واجهة مستخدم الموائع الدقيقة ، قم بغرس محلول البروتين بمعدل تدفق مشابه لمعدل السحب. استمر في التسريب بهذا المعدل حتى يصل محلول البروتين إلى خلية التدفق. ثم قم بتعيين معدل التدفق إلى قيمة مناسبة للتراكب اللوني وانتظر حتى يتم تثبيت التتبع.
تحقق من تطابق الحجم والوقت على مضخة الحقنة مع القيم المتوقعة. لتسجيل بيانات إشارة APD، اضبط المحاور X وY وZ حسب الحاجة باستخدام واجهة مستخدم وحدة التحكم الكهروإجهادية. عند ملاحظة تغيير كبير في الإرسال والانحراف المعياري ، قم بتدوين الوقت الذي يحدث فيه ذلك لفرز البيانات في المستقبل. إذا احتاج البروتين إلى الإفراج كجزء من التجربة ، فقم بإيقاف تشغيل الليزر لمدة خمس ثوان تقريبا ، ثم أعد تشغيله.
يجب أن يكون للتتبع تغيير كبير في الإرسال وانحراف معياري أقل بكثير ، مما يشير إلى العودة إلى حالة خط الأساس. بعد الانتهاء من التجربة ، قم بإيقاف تشغيل الليزر. قم بإزالة خلية التدفق من المرحلة ثلاثية المحاور وافصل أنبوب نظام الموائع الدقيقة.
ضع خلية التدفق على منديل نظيف بحيث تكون الطبقة الذهبية متجهة لأعلى. باستخدام مشرط ، قم بقص الغراء بعناية أسفل زلة الغطاء الزجاجي قبل رفعه برفق والتخلص منه. أمسك خلية التدفق بزاوية مع استمرار الطبقة الذهبية متجهة لأعلى واستخدم ملاقط مستديرة لإزالة الغراء بعناية من الجانب السفلي من خلية التدفق لتحرير العينة.
باستخدام ملاقط مستقيمة ، التقط العينة واشطفها جيدا باستخدام الأيزوبروبانول. جفف العينة باستخدام مسدس هوائي. توضح تجربة تمثيلية أجريت على تحميل الحديد في الموقع إلى جزيء الأبوفيريتين استخدام الموضازات البلازمونية كأداة للتحقيق في ديناميكيات مطابقة البروتين.
يظل أثر انتقال الأبوفيريتين مستقرا عند احتجازه في محلول PBS ، مما يشير إلى عدم وجود تغييرات توافقية كبيرة. عند التعرض للمحلول الحديدي ، زادت التقلبات في الانحرافات المعيارية للتتبع ، مما يشير إلى التغيرات الهيكلية الديناميكية المرتبطة بتحميل الحديد. بعد 20 دقيقة من التعرض للحديد ، استقر أثر الانتقال ، مما يشير إلى انتقال الأبوفيريتين إلى شكله المجسم.
أظهرت مخططات دالة الكثافة الاحتمالية تحولا في توزيع الجهد عند تحميل الحديد ، مما يدعم الانتقال التوافقي من الأبوفيريتين إلى الهولوفيريتين.
نظرة عامة
تستكشف هذه الدراسة استخدام الملقط النانوتي بلاسموني لمراقبة البروتينات الخالية من العلامات في الوقت الفعلي على مستوى الجزيء الفردي. تسمح التقنية بدراسة ديناميكيات تشكل البروتينات دون الحاجة إلى تعديلات الفلوروفور.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- الفيزياء الحيوية
- الكيمياء الحيوية
الخلفية
- تكافح التقنيات الحالية في دراسة ديناميكيات البروتينات الفردية الخالية من العلامات.
- يستخدم الملقط النانوتي بلاسموني رنين البلازمون السطحي الموضعي.
- يمكنه مراقبة التغيرات التشكلية للبروتين وأحداث الارتباط.
- مرتبط بأمراض مثل الزهايمر وباركنسون.
هدف الدراسة
- للتحقيق في العلاقة بين التغيرات التشكلية للبروتين والوظائف البيولوجية.
- لملء الفجوة في التقنيات المستخدمة في دراسة البروتينات الخالية من العلامات.
- للتركيز على البروتينات غير المرتبة بطبيعتها والبروتينات الغشائية المتورطة في الأمراض.
الطرق المستخدمة
- إعداد العينات في خلية تدفق مطبوعة ثلاثية الأبعاد.
- استخدام أنظمة دقيقة الجريان للتحكم في ضخ البروتينات.
- مراقبة التفاعلات البروتينية في الوقت الفعلي باستخدام الملقط النانوتي بلاسموني.
- جمع البيانات من خلال تسجيل ديود السيليكون الضوئي المتسلسل (APD).
النتائج الرئيسية
- مراقبة ناجحة لديوناميكات تشكل البروتينات على مستوى الجزيء الفردي.
- قدرة مثبتة على ملاحظة حركية الارتباط والتفكك.
- تقديم رؤى حول المناظر الطبيعية للطاقة الحرة للبروتينات.
- إبراز الإمكانات للدراسات المستقبلية على البروتينات المرتبطة بالأمراض.
الاستنتاجات
- يعد الملقط النانوتي بلاسموني أداة واعدة لدراسة البروتينات الخالية من العلامات.
- يمكنه الكشف عن رؤى حاسمة حول سلوك البروتينات ذات الصلة بالأمراض.
- ستوسع الأبحاث المستقبلية تطبيقها على مختلف البروتينات الصعبة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Plasmonic nanotweezers enable real-time, label-free monitoring of single protein conformational dynamics, addressing a critical gap in early discovery and mechanistic de-risking. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports portfolio decisions for disease-relevant proteins, including those implicated in neurodegeneration and cancer. The approach offers enterprise R&D teams a scalable, non-perturbative method for interrogating protein function under native conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of conformational changes in unmodified proteins at the single-molecule level.
- Supports mechanistic de-risking by linking structural dynamics to biological function and disease relevance.
- Facilitates target validation for proteins previously inaccessible to label-dependent techniques.
- Provides real-time data on protein-ligand interactions and assembly/disassembly kinetics.
Screening & Assay Development
- Delivers quantitative, label-free readouts of protein conformational states for assay standardization.
- Enables reproducible monitoring of protein responses to environmental or compound perturbations.
- Supports development of screening platforms for challenging targets such as intrinsically disordered or membrane proteins.
- Allows for rapid adaptation to new protein systems without re-engineering labeling strategies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant protein targets implicated in neurodegenerative and oncologic pathways.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical model selection.
- Enables risk-adjusted advancement by revealing conformational biomarkers and dynamic signatures.
- Supports translational biomarker identification through real-time monitoring of protein state transitions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven interrogation of protein dynamics, supporting both early-stage target validation and downstream translational research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on protein structure-function relationships and pathway engagement.
- Screening: Provides quantitative, reproducible outputs for compound or condition screening in native-like environments.
- Analytics: Generates high-resolution, time-resolved data on conformational changes and kinetic profiles.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to disease models by tracking protein state changes relevant to pathology.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, label-free platform adaptable to diverse protein targets and workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-molecule protein analysis without the need for labeling or non-native conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by providing actionable, real-time data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on dynamic structural insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plasmonics, microfluidics, and single-molecule biophysics.
- Demands specialized instrumentation including gold nanostructures, APD detection, and microfluidic control.
- Necessitates cross-team standardization for data acquisition and analysis protocols.
- Adaptable to a range of protein systems but may require optimization for specific targets.
- Limited by the need for precise environmental control and potential throughput constraints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:26
Mounting the PEG Coated Sample into a Flow Cell
3:12
Preparing Microfluidics System and Mounting the Flow Cell into Plasmonic Nanotweezers
4:33
Locating Nanostructures on Sample
5:34
Optimally Aligning the Laser with the Desired Nanostructure and Infusing Proteins into the Flow Cell
6:59
Collecting Data and Unmounting the Sample
8:29
Results
