مراقبة الديناميكيات التوافقية للبروتينات المفردة غير المعدلة باستخدام نساقطات النوتوزان البلازمونية

يهدف هذا البحث إلى اكتساب نظرة ثاقبة للبروتينات الخالية من الملصقات على مستوى الجزيء الفردي في الوقت الفعلي ، مع التركيز بشكل خاص على البروتينات التي يصعب التحقيق فيها باستخدام التقنيات الحالية أو لها صلة بالأمراض. أثبتت اللوثان النانوي البلازموني مؤخرا قدرتها على مراقبة الديناميكيات التوافقية عند الارتباط بجزيئات صغيرة ، والتحقق من حركية التفكيك ، وتوضيح المناظر الطبيعية للطاقة الحرة ، كل ذلك على مستوى الجزيء الواحد. حاليا ، لا توجد تقنية توصيف بروتين راسخة قادرة على التحقيق في ديناميكيات تركيب البروتين أحادي الجزيء الخالية من الملصقات.

يعتقد أن الناسق البلازموني لديه القدرة على ملء هذا المكان في هذا المجال. تساعدنا هذه الميزة الفريدة على التحقيق في العلاقة بين التغيير التوافقي للبروتينات ووظائفها البيولوجية والآثار المترتبة على تطور المرض. ستركز الأبحاث المستقبلية على البروتينات المضطربة جوهريا والبروتينات الغشائية ، حيث أن العديد منها متورط في العديد من الأمراض مثل مرض الزهايمر وباركنسون وأنواع مختلفة من السرطان.

للبدء ، ضع العينة المطلية ب PEG-thiol في خلية التدفق المطبوعة ثلاثية الأبعاد باستخدام ملاقط مستقيمة ، مما يضمن أن الطبقة الذهبية متجهة لأعلى. انزع جانبا واحدا من غطاء الشريط البلاستيكي الشفاف على الوجهين PET. ضع الشريط بعناية فوق العينة وخلية التدفق ، مع التأكد من بقاء الهياكل النانوية وفتحات السحب / السحب في خلية التدفق مكشوفة.

باستخدام ملاقط مستديرة ، اضغط برفق حول حواف الشريط لتأمين التصاقه بخلية التدفق والعينة. انزع الجانب الآخر من الشريط وضع غطاء زجاجي برفق فوق العينة. استخدم ملاقط مستديرة للضغط حول حواف زلة الغطاء لتأمين التصاقها.

تخلق هذه العملية قناة سائلة داخل خلية التدفق بارتفاع 50 ميكرومتر وحجم 3.5 ميكرولتر. باستخدام طرف ماصة صغير، امزج أجزاء متساوية من المحلول A والمحلول B من السيليكون المكرر على شريحة مجهرية بنسبة واحد إلى واحد أو يتم تحديدها من قبل الشركة المصنعة. املأ الفجوات بين انزلاق الغطاء وخلية التدفق بسيليكون مزدوج مختلط ، وادفعه برفق أسفل زلة الغطاء.

أمسك خلية التدفق رأسا على عقب وقم بتطبيق السيليكون المكرر بعناية حول الجدار الداخلي للفتحة. حرك السيليكون برفق على الحواف المرئية للجانب السفلي من السيليكا المنصهرة من العينة ، واترك العينة لتجف مع توجيه الطبقة الذهبية لأعلى حتى يتم ضبط السيليكون المكرر بالكامل. بعد التحقق من توصيل جميع المكونات بشكل صحيح ، قم بتحميل واجهة مستخدم نظام الموائع الدقيقة على الكمبيوتر.

انقر فوق أيقونة التشغيل بجوار موزع MUX والسلك ، اللذين يتحكمان في الصمام الدوار 12 × واحد والصمام ثلاثي في اتجاهين على التوالي لفتح الواجهات المقابلة لهما. لتجاوز الصمام ثلاثي في اتجاهين ، قم بتشغيل المنفذ الأول من السلك. لتركيب خلية التدفق في نسقط البلازموني ، قم بتوصيل أنابيب المدخل والمخرج بالأجزاء المناسبة من خلية التدفق.

ضع خلية التدفق على منديل نظيف بحيث تكون الطبقة الذهبية متجهة لأعلى. قم ببث المخزن المؤقت في خلية التدفق بمعدل تدفق عال يبلغ حوالي 0.3 مل في الدقيقة. تأكد من أن السائل يتحرك عبر العينة داخل خلية التدفق وأنه لا يوجد سائل مرئي على الجانب الخارجي أو السفلي.

ضع قطرة أو قطرتين من زيت الغمر على هدف 100X. ضع خلية التدفق في مرحلة النساقط البلازموني مع توجيه الطبقة الذهبية لأسفل. قم بتأمين خلية التدفق باستخدام مشابك معدنية فوق المغناطيس وقفل المسرح لإبقائها في مكانها.

قم بتشغيل مصدر الضوء الأبيض. افتح برنامج الكاميرا واضبط وقت التعرض والكسب حتى تصبح هياكل النانو مرئية. قم بتشغيل الليزر بطاقة عالية نسبيا واضبط المحور Z يدويا حتى تظهر بقعة الليزر.

قم بتشغيل وحدة التحكم الكهروإجهادية وحدد الإعدادات المناسبة لمنفذ الاتصال والحد الأقصى للجهد. اضبط قيم المحور X و Y و Z على نصف الحد الأقصى للجهد للسماح بمحاذاة أفضل للمرحلة في جميع الاتجاهات. قم بمحاذاة بقعة الليزر مع أحد ثقب النانو المزدوج أو هياكل DNH باستخدام مقابض التحكم في المحور الرئيسي X و Y و Z.

تأكد من تشغيل الصمام الثنائي لصور الانهيار الجليدي أو APD. أغلق العلبة برفق على الملقط البلازموني. افتح البرنامج المرتبط بتسجيل APD، مثل واجهة مستخدم LabVIEW محلية الصنع. قم بتحرير اسم الملف وتعيين تردد القطع إلى كيلو هرتز واحد.

ثم حدد مسار الملف المطلوب حيث سيتم حفظ الملفات. قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء الأبيض وإعادة تشغيل الليزر. بعد ضبط طاقة الليزر على مستوى مناسب ، استخدم عناصر التحكم الكهروإجهادية لضبط المحاور X و Y و Z حتى تصبح إشارة APD عالية قدر الإمكان.

تجنب تشبع APD وبأقل انحراف معياري للتتبع. بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل الليزر للحفاظ على عمر الهياكل النانوية. قم بتشغيل وحدة التحكم في مضخة الحقنة وواجهة مستخدم الموزع لضبط الصمام وسحب الكمية المطلوبة من البروتين.

باستخدام واجهة مستخدم الموائع الدقيقة ، قم بغرس محلول البروتين بمعدل تدفق مشابه لمعدل السحب. استمر في التسريب بهذا المعدل حتى يصل محلول البروتين إلى خلية التدفق. ثم قم بتعيين معدل التدفق إلى قيمة مناسبة للتراكب اللوني وانتظر حتى يتم تثبيت التتبع.

تحقق من تطابق الحجم والوقت على مضخة الحقنة مع القيم المتوقعة. لتسجيل بيانات إشارة APD، اضبط المحاور X وY وZ حسب الحاجة باستخدام واجهة مستخدم وحدة التحكم الكهروإجهادية. عند ملاحظة تغيير كبير في الإرسال والانحراف المعياري ، قم بتدوين الوقت الذي يحدث فيه ذلك لفرز البيانات في المستقبل. إذا احتاج البروتين إلى الإفراج كجزء من التجربة ، فقم بإيقاف تشغيل الليزر لمدة خمس ثوان تقريبا ، ثم أعد تشغيله.

يجب أن يكون للتتبع تغيير كبير في الإرسال وانحراف معياري أقل بكثير ، مما يشير إلى العودة إلى حالة خط الأساس. بعد الانتهاء من التجربة ، قم بإيقاف تشغيل الليزر. قم بإزالة خلية التدفق من المرحلة ثلاثية المحاور وافصل أنبوب نظام الموائع الدقيقة.

ضع خلية التدفق على منديل نظيف بحيث تكون الطبقة الذهبية متجهة لأعلى. باستخدام مشرط ، قم بقص الغراء بعناية أسفل زلة الغطاء الزجاجي قبل رفعه برفق والتخلص منه. أمسك خلية التدفق بزاوية مع استمرار الطبقة الذهبية متجهة لأعلى واستخدم ملاقط مستديرة لإزالة الغراء بعناية من الجانب السفلي من خلية التدفق لتحرير العينة.

باستخدام ملاقط مستقيمة ، التقط العينة واشطفها جيدا باستخدام الأيزوبروبانول. جفف العينة باستخدام مسدس هوائي. توضح تجربة تمثيلية أجريت على تحميل الحديد في الموقع إلى جزيء الأبوفيريتين استخدام الموضازات البلازمونية كأداة للتحقيق في ديناميكيات مطابقة البروتين.

يظل أثر انتقال الأبوفيريتين مستقرا عند احتجازه في محلول PBS ، مما يشير إلى عدم وجود تغييرات توافقية كبيرة. عند التعرض للمحلول الحديدي ، زادت التقلبات في الانحرافات المعيارية للتتبع ، مما يشير إلى التغيرات الهيكلية الديناميكية المرتبطة بتحميل الحديد. بعد 20 دقيقة من التعرض للحديد ، استقر أثر الانتقال ، مما يشير إلى انتقال الأبوفيريتين إلى شكله المجسم.

أظهرت مخططات دالة الكثافة الاحتمالية تحولا في توزيع الجهد عند تحميل الحديد ، مما يدعم الانتقال التوافقي من الأبوفيريتين إلى الهولوفيريتين.