عزل واستزراع خلايا مولر الشبكية الأولية من فئران Sprague-Dawley (SD)

يصف هذا البروتوكول عزل وثقافة خلايا مولر الشبكية الأولية من فئران Sprague-Dawley SD ، والتي يمكن أن تساعد في أبحاث الشبكية في المجتمع العلمي. يغطي البروتوكول ، تشريح الشبكية ، واستخراج CI وتحديده ، واعتبارات التحكم الرئيسية. ينشئ هذا البروتوكول طريقة فعالة وموحدة وفعالة مكلفة لاستخراج واستعادة RMCs من رفوف SD القانونية الخاصة بك. يمكن استخدام نموذج RMC لمحاكاة الحالات المرضية مثل مرض السكري والحياة الطبيعية وللمساعدة في تأثيرات الأدوية.

[الراوي] للبدء صب محلول D-Hank في طبقين زجاجيين بحجم 10 سم. بعد القتل الرحيم وتطهير الجرذ SD حديثي الولادة ، ضعه على طبق منحني معقم. باستخدام ملاقط الأسنان ، قم بتمزيق جلد الجفن على طول الشق الجني لكشف مقلة عين الفئران. أمسك الملقط بدون أسنان مفتوحا وموازيا للشق الجني للضغط على الحجاج. بمجرد الوصول إلى العصب البصري وكشف مقلة العين ، أغلق الملقط لرفع مقلة العين واستخراجها. الآن ضع مقلة العين في طبق ثقافة زجاجي بمحلول D-Hank. اشطف مقلة العين وانقلها إلى طبق آخر بمحلول D-Hank الطازج. ثم باستخدام ملقط العين المجهري المنحني ، قم بإصلاح المنطقة الواقعة بين القرنية والعصب البصري برفق لكشف القرنية. اخترق تقاطع صلبة القرنية باستخدام مقص القرنية الدقيقة وقم بقصها على طول الأطراف بطريقة دائرية. قم بعمل شقين صلبيين متماثلين بطول ملليمترين تقريبا قبل تحرير الملقط وإعادة التثبيت عند تقاطع العصب البصري والصلبة. بعد ذلك ، استخدم ملقطا ثانيا للضغط برفق بالقرب من جذر العصب البصري الذي يوجه الضغط نحو واجهة العصب البصري للقرنية. عندما تظهر أنسجة العدسة ، قم بإزالتها بعناية واستمر في الضغط حتى تظهر أنسجة الشبكية. باستخدام الملقط ، انقل أنسجة الشبكية المنفصلة إلى طبق مزرعة معقم آخر. افتح غطاء طبق المزرعة واستخدم ماصة برأس مليلتر واحد لماصة أنسجة الشبكية لأعلى ولأسفل حوالي 15 مرة لتقسيمها إلى قطع صغيرة. بعد ذلك ، احتضن الأنسجة بمليلتر واحد من 0.25٪ تربسين عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أخرج طبق الثقافة من الحاضنة وضعه على المقعد النظيف. أضف ملليلترين من الوسط الكامل والماصة برفق لوقف الهضم. الآن قم بتصفية تعليق الخلية من خلال شاشة نايلون شبكية 300 إلى جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر اثنين. اغسل طبق الثقافة باستخدام PBS المحضر واجمع المعلق المتبقي. ثم قم بتدوير الأنبوب عند 878 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، قم بالشفط والتخلص منه. أعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من الوسط الكامل والطرد المركزي مرة أخرى عند 878 جم لمدة خمس دقائق لتنقية الخلايا. بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بإعادة تعليق الخلايا في ملليلترين من الوسط الكامل. خذ قارورة T25 مع ثلاثة ملليلتر من الوسط الكامل وأضف ملليلترا واحدا من تعليق الخلية. رج القارورة بنمط متقاطع قبل وضعها في الحاضنة. بعد 48 ساعة من الحضانة ، أخرج القارورة من الحاضنة وضعها على المقعد النظيف. تخلص من الوسط المستهلك واغسل السطح الملتصق بالخلية ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من PBS ، والذي يحتوي على 1٪ بنسلين بالإضافة إلى الستربتومايسين. ثم أضف خمسة ملليلتر من الوسط الطازج الكامل ، واستمر في الحضانة حتى يتجاوز التقاء الخلية 90٪. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من PBS يحتوي على 1٪ بنسلين ستربتومايسين. ثم احتضان الخلايا بملليلتر واحد من محلول التربسين EDTA بنسبة 0.25٪ لمدة دقيقة واحدة و 30 ثانية. الآن ، راقب القارورة تحت المجهر المقلوب. عندما تظهر الخلايا مستديرة ومنفصلة وتبدأ في الطفو ، أضف ملليلترين من وسط الثقافة الكامل إلى القارورة لإنهاء الهضم. ثم استخدم ماصة لشفط تعليق الخلية ونقل معلق الخلية بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا. اشطف جدار القارورة بملليلترين من PBS الذي يحتوي على 1٪ بنسلين ستربتومايسين ، وأضفه إلى نفس الأنبوب. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 878 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في حجم مناسب من الوسط الكامل. أخيرا ، قم بتمرير الخلايا بنسبة واحد إلى اثنين أو واحد إلى ثلاثة ، حسب الحاجة. عرضت خلايا مولر الشبكية أو RMCs في المقطع الثاني مورفولوجيا على شكل نجمة أو على شكل مغزل مع نوى مستديرة أو بيضاوية وسيتوبلازم وفير. كشف تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين عن خلايا مغزلية ونجمية ذات سيتوبلازم وردي وفير ونواة بيضاوية مركزية مترابطة بهياكل خيطية دقيقة. كشف تلطيخ التألق المناعي ل RMCs عن تألق أحمر قوي في الخلايا المسماة ب Glutamine Synthetase و Aquaporin-4 والتألق الأخضر الفاتح ل CRALBP و Kir4.1 و Vimentin. NeuN ، لم يتم الكشف عن التحكم السلبي في تحليل التألق المناعي الذي يؤكد خصوصية عزل RMC. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن 98.7٪ من الخلايا كانت إيجابية ل Glutamine Synthetase و 97٪ كانت إيجابية ل CRALBP ، مما يشير إلى نقاء عال ل RMCs.