إنشاء وتحليل نسيجي للعضيات المريئية لنمذجة التقدم من الأنسجة الطبيعية إلى الأنسجة السرطانية

يركز بحثنا على بدء الورم وتكوين الأورام المبكر. ندرس كيف تتحول الخلايا الطبيعية إلى خلايا سرطانية ، وكيف تعدل هذه الخلايا بيئتها المكروية لتسهيل تكوين الأورام. في الوقت الحاضر ، هناك العديد من التقنيات المستخدمة لتعزيز البحث ، بما في ذلك تقنيات الخلايا الجذعية وتقنيات تحرير الجينات ونظام الاستزراع ثلاثي الأبعاد المتقدم والمواد الحيوية وتقنيات omics أحادية الخلية والمكانية. التحدي الأكبر الذي نواجهه هو الحفاظ على العضيات خالية من البكتيريا والفطريات. تتسلل هذه الملوثات أثناء التعامل مع الأنسجة ونقلها ، وغالبا ما تدمر ثقافاتنا.

[مدرب] للبدء ، قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي ووسط الثقافة العضوية للمريء البشرية عند أربع درجات مئوية. انقل عينة الأنسجة إلى أنابيب طرد مركزي سعة خمسة ملليلتر ، ثم اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام محلول غسيل بدرجة حرارة الغرفة. باستخدام مقص معقم ، قم بفرم الأنسجة إلى شظايا مكعبة ملليمتر واحد في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر. الآن ، قم بتعليق شظايا الأنسجة في مليلتر واحد من عازلة الهضم. رج الخليط على حرارة 37 درجة مئوية عند 50 إلى 100 دورة في الدقيقة لمدة 10 إلى 20 دقيقة لهضم الأنسجة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخليط على حرارة 400 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم تخلص من الطافف. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من 0.025٪ Trypsin-EDTA. احتضان التعليق عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم أضف ملليلتر واحد من DMEM مع مصل بقري الجنين بنسبة 10٪ لوقف النشاط الأنزيمي. بعد ذلك ، قم بتمرير التعليق من خلال مرشح معقم 70 ميكرومتر وجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. جهاز الطرد المركزي للمرشح لمدة خمس دقائق عند 400 جرام عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من H-EOCM بعد التخلص من المادة الطافية. بعد إعادة تعليق الخلايا ، حدد كثافة الخلية باستخدام عداد الخلايا. ثم انقل 5,000 إلى 15,000 خلية لكل مليلتر إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. للبذر العضوي ، قم بتعليق الخلايا برفق في 50 إلى 100 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي. ماصة 50 ميكرولتر من خليط خلية المصفوفة في وسط كل بئر من صفيحة 24 بئرا. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لبلمرة مصفوفة الغشاء القاعدي. الآن ماصة 500 ميكرولتر من H-EOCM الدافئ مسبقا لكل بئر لتغطية المصفوفة. ثم احتضان اللوحة في حاضنة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. لاستبدال الوسيط ، استنشق الوسط المستهلك. جدد كل بئر ب 500 ميكرولتر من H-EOCM الطازج المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. لإجراء تلطيخ التألق المناعي متعدد الإرسال على العضيات المعاد ترطيبها والمعاد ترطيبها. أضف محلول حجب مصل الأغنام لتغطية العضيات على شريحة موضوعة في غرفة الرطوبة واحتضان الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اغسل الشريحة باستخدام Tween المحتوي على PBS لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بإسقاط الجسم المضاد الأولي المخفف لتغطية المنطقة العضوية. احتضان في غرفة الرطوبة وفقا لمتطلبات الأجسام المضادة. بعد الحضانة ، اغسل الشرائح في PBS-T مرتين لمدة دقيقتين عند 80 مساء في الدقيقة في غرفة مقاومة للحرارة. الآن قم بإسقاط محلول الأجسام المضادة الثانوية على المنطقة العضوية واحتضانه في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل الشرائح في PBS-T مرتين لمدة دقيقتين عند 80 دورة في الدقيقة في غرفة قابلة للحرارة. محلول صبغة الفلورسنت الماصة فوق الشريحة المغسولة لتغطية المنطقة العضوية واحتضانها مرة أخرى. بعد الحضانة ، اغسل الشرائح في PBS-T مرتين. لتعدد البقع ، كرر استرجاع المستضد وحجب الأجسام المضادة. ثم قم بإسقاط محلول رقيق لتغطية المنطقة العضوية. اغمر الشرائح في ماء معقم لمدة دقيقتين لغسل البقعة الزائدة. أضف وسيط التثبيت المضاد للبهتان وقم بتطبيق زلة الغطاء قبل الحصول على الصور الرقمية. أصبحت الهياكل العضوية غير منظمة بشكل متزايد من المراحل الطبيعية إلى المراحل السرطانية ، كما يتضح من تلطيخ KRT6A. زاد التعبير عن PDL1 تدريجيا من الغشاء المخاطي للمريء الطبيعي إلى سرطان الخلايا الحرشفية في المريء.