أون الوجه التقطيع بالتبريد لشبكية العين الفأرية للتحليل الجزيئي المكاني عالي الأبعاد

شبكية العين هي نموذج مفيد لفهم الحسابات العصبية. تعتمد هذه الحسابات على المواضع الخاصة للخلايا. ومع ذلك ، ظلت الخرائط الشاملة لهذا بعيد المنال.

على مدى العقد الماضي ، قدم تسلسل الخلية المفردة أوصافا واضحة لأنواع خلايا الشبكية. الآن ، توفر النسخ المكانية طريقة جديدة لاستخدام هذه الأوصاف في الأنسجة السليمة. يتمثل التحدي الحاسم لاستخدام النسخ المكانية في أنها تتطلب أقساما رقيقة جدا من الأنسجة. شبكية العين رقيقة جدا بالفعل في المستوى الأفقي الذي نهتم به.

من خلال اختراع هذه الطريقة لإنشاء أقسام رفيعة وسريعة ، لاستخدام النسخ المكانية في التعلم الآلي لرسم خريطة لجميع الخلايا العقدية الشبكية في نفس الأنسجة. على مدى السنوات الثلاثين الماضية ، تم رسم خرائط فقط ل 17 من أصل 45 خلية عقدية شبكية للفأر ، ومكنتنا هذه التقنية من رسم خرائط لها جميعا مرة واحدة.

[مدرب] للبدء ، ضع فأرة قتلى رحيم على طاولة العمل. ركض القطب الزمني للكرة الأرضية على القرنية للحفاظ على الاتجاه وخلق نقطة ضعف للتشريح. اغمر الكرة الأرضية وصوب المحلول في طبق يحتوي على قطعة من ورق الترشيح. باستخدام ملقط حاد رقم خمسة ومقص قزحية ، قم بإزالة جميع العضلات واللفافة والأوعية الدموية والأعصاب بعناية من الكرة الأرضية دون ثقب الصلبة. ضع طرف شفرة مقص القزحية بشكل عمودي على ماركة القرنية. ثقب الكرة الأرضية في هذا الموقف. قم بعمل شق واحد نظيف عبر القرنية والأطراف ، مع الاستمرار في الصلبة وشبكية العين باتجاه رأس العصب البصري. ثم ضع الشفرة بشكل عمودي على القطع الأولي ، حوالي ملليمتر واحد خلف الطرف. ابدأ بقطع الصلبة والشبكية شعاعيا. حافظ على خط قطع متسق خلفيا وموازيا للطرف باستخدام ملقط حاد لتوجيه الكرة الأرضية وتدويرها. إذا انفصلت الشبكية عن الصلبة ، فقم بتغيير وضع شفرة مقص القزحية لقطعها معا. قم بتقدير المسافة الخلفية المليمتر الواحد باستخدام العرض الأوسط لشفرة مقص القزحية بعد الانتهاء من القطع الشعاعي الموازي للطيفي ، افحص اتصالات الشبكية المتبقية. قم بقطعها بعناية باستخدام مقص القزحية حتى يتم فصل أقسام الكرة الأرضية الأمامية والخلفية. بعد ذلك ، استخدم زوجين من الملقط الحاد رقم خمسة لفصل الأجزاء الأمامية والخلفية من الكرة الأرضية برفق. في الفئران الأكبر سنا ، إذا كانت الألياف الشفافة تربط العدسة بكوب الشبكية ، فقم بقطعها بعناية باستخدام مقص القزحية مع تقليل انفصال صلبة الشبكية. باستخدام ورق الترشيح كمنصة دعم ، قم بتقطيع شبكية العين إلى ورقة برسيم ، وتسمى أيضا نمط الصليب الحديدي بمقص القزحية. كرر التشريح بالعين الثانية. قم بقص طرف ماصة نقل بلاستيكية يمكن التخلص منها لإنشاء فتحة أكبر من شبكية العين والصلبة المقطعة. قم بشفط شبكية العين برفق في الماصة ووضعها على شريحة مجهر زجاجي. باستخدام منديل مختبري ، قم بإزالة محلول التصويب الزائد حتى تختفي شبكية العين من الطفو ويمكن تسويتها. استخدم الآن ملقطين حادين رقم خمسة لفتح شبكية العين ووضعها بشكل مسطح مع توجيه كوب العين الداخلي لأعلى. قم بعمل قطع إغاثة بطول 0.5 إلى ملليمترين في كل جزء من أجزاء تخفيف البرسيم للمساعدة في التسطيح والضبط لمنع الطي. قم بإزالة أي محلول تصويب متبقي باستثناء السائل المجاور لشبكية العين. باستخدام زلة الغطاء، اضغط على شبكية العين وانقلها بسرعة بحيث تتجه الصلبة الخارجية لأعلى ويكون كوب العين الداخلي ملامسا لزلة الغطاء. تحقق من عدم طي الشبكية وقم بإجراء التعديلات إذا لزم الأمر. أضف محلول التصويب للمساعدة في التلاعب ، ولكن قم بإزالة الفائض بمنديل لمنع التجعيد والسماح بتجفيف الهواء لمدة خمس إلى 10 ثوان. الآن ضع وسيط OCT لتغطية شبكية العين. ثم استخدم الملقط لتوزيع الطبقة بالتساوي عبر زلة الغطاء لمنع التعويم. قم بتجميد شبكية العين في وسط OCT باستخدام صفيحة معدنية مبردة ببخار النيتروجين السائل ، أو عن طريق ملامسة الثلج الجاف مباشرة. قم بتخزين شبكية العين المجمدة على الثلج الجاف للاستخدام الفوري. للتقطيع بالتبريد ، قم بإنشاء قبة OCT على ظرف العينة ، وتشغل الحلقات الداخلية من اثنين إلى ثلاثة في حالة استخدام نفس نموذج ناظم البرد. قم بمحاذاة ظرف العينة بشكل مسطح مع سطح القطع. قم بإنشاء أو ملاحظة دليل التوجيه المرتبط بالظرف بمرحلة ناظم البرد. ثم قم بقص القبة لتشكيل سطح مستو مواز للشفرة. باستخدام شفرة الحلاقة ، قم بإزالة OCT الزائد بشكل جانبي وافصل شبكية العين بعناية عن زلة الغطاء لجعلها متحركة. قم بإزالة ظرف الظرف من المسرح وقم بتطبيق قطرة صغيرة من السائل OCT على سطح OCT المسطح المجهز. بعد ذلك ، ضع شبكية العين مباشرة على السائل OCT. استخدم شريحة زجاجية مبردة مسبقا للضغط على شبكية العين مع الاستمرار حتى تتجمد. ضع المزيد من OCT على شبكية العين والظرف لضمان الترابط. ثم قم بتجميد التجميع في منطقة التجميد السريع الناجمة عن البرد. للتقسيم ، قم بقص OCT الزائد بعناية حتى تظهر شبكية العين. استخدم شفرة حلاقة لتشكيل حواف كتلة OCT بالقرب من شبكية العين. استمر في التشذيب أثناء فحص وجود الصلبة. عندما تكون الصلبة مرئية ، اضبط زاوية المرحلة حسب الحاجة. توقف عن التشذيب عندما يتم توزيع الصلبة بالتساوي تقريبا عبر الأقسام. الآن ، استخدم شرائح مبردة مسبقا وفرشتي طلاء لمعالجة الأقسام وجمعها. ضع إصبعا أسفل القسم لمدة خمس ثوان تقريبا حتى يذوب OCT ويلتصق بالأنسجة بالشريحة. ثم أعد الشريحة إلى سطح بارد لإعادة التجميد. قم بتخزين الشرائح المحضرة على الثلج الجاف للاستخدام الفوري. أكد النشاط المناعي المميز أو RBPMS في طبقة الخلايا العقدية والفصل الواضح للشبكي الوعائي المسمى بواسطة ليكتين الطماطم الحفاظ الناجح على تصفيح الشبكية وعلامات البروتين. نجح اكتشاف الحمض النووي الريبي المتعدد باستخدام لوحة نطاق الحمض النووي الريبي 12 plex في الحفاظ على البنية المكانية وكشف عن تعبير مميز عن علامات مثل Grm6 و RBPMS عبر شريحة الوجه. أكدت الصور عالية الدقة أنماط تعبير الخلية المفردة ل RBPMS وعلامات أخرى مثل Mafb6 و Meis2 ، مما يتحقق من صحة توطين البروتين والحمض النووي الريبي في طبقة الخلية العقدية. أكد التوزيع المنتظم للإشارة عبر أقسام أوراق البرسيم والإشارات القوية في بيانات النسخ المكانية للزينيوم نجاحا في التنميط عالي الإنتاجية وسلامة الحمض النووي الريبي. تصور دقة خلية واحدة باستخدام أنماط الكشف اليدوي المتطابقة مع الزينيوم مما يؤكد متانة البروتوكول عبر الأنظمة الأساسية. أظهرت علامات النسخ الخاصة بنوع الخلية توزيعا رقائقيا طبقيا في المقطع العرضي للشبكية وعلى رسم خرائط الوجه ، وحافظت على موقعها عبر الأعماق. أكد التكبير التفصيلي لطبقة الخلية العقدية اكتشافا دقيقا للنسخة المكانية بالنسبة إلى تلطيخ DAPI النووي.