تحسين توصيل الجينات والتعبير عنها باستخدام الحقن داخل العظام لجزيئات الشيتوزان النانوية المغلفة بلازميدات محرر قاعدة الأدينين
مايو 16, 2025
هنا ، نقدم نهجا للعلاج الجيني يقوم بتوصيل الشيتوزان المطلي ب ABE مباشرة إلى نخاع العظم عن طريق الحقن داخل العظم.
نقترح طريقة العلاج الجيني التي توصل مباشرة المحرر القائم على الأدينين الشيتوزان إلى نخاع العظم من خلال الحقن داخل العظام. كفاءة تعداء البلازميدات الخارجية إلى التجارب منخفضة نسبيا وقد يتأثر إدخال البلازميدات للتعبير الجيني على المدى الطويل بجهاز المناعة. نستخدم الشيتوزان لتغليف بلازميدات المحرر القائمة على الأدينين وتوصيل المركب مباشرة إلى نخاع عظم الفئران من خلال الحقن داخل العظم ، مما يجعله مناسبا للأمراض التي تسببها وظيفة ناقضات العظم غير الطبيعية.
يوفر بروتوكولنا كفاءة تعداء عالية ، وأضرار بيولوجية صغيرة ، وكفاءة عالية في التعبير الجيني. استراتيجيتنا الجديدة ليست مناسبة فقط للأمراض التي تسببها وظيفة ناقضات العظم غير الطبيعية ، ولكنها تتمتع أيضا بإمكانيات كبيرة للنهوض بمجال العلاج الجيني. للبدء ، ضع فأرة مرح على طاولة عمل.
باستخدام المقص الجراحي والملاقط ، قم بإزالة الظنبوب وإزالة جميع الأنسجة العضلية المحيطة. انقعي الساق النظيف في PBS واغسليه حتى يتبقى العظم فقط. ارسم مليلترا واحدا من PBS في حقنة واغسل خلايا نخاع العظم من أحد طرفي الظنبوب حتى يتحول لون العظم إلى اللون الأبيض تماما.
بعد ذلك ، اجمع تعليق الخلية في أنبوب. قم بالطرد المركزي عند 800 جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد إخراج المادة الطافية ، أضف 500 ميكرولتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء إلى الحبيبات.
بعد دقيقة ، أضف مليلتر واحد من المخزن المؤقت للفصل لإنهاء التحلل. جهاز الطرد المركزي التعليق مرة أخرى عند 800 جرام عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وضع حبيبات الخلية الناتجة على الثلج لاستخدامها لاحقا.
لتعداء الشيتوزان ، قم بإذابة أربعة ملليغرامات من الشيتوزان في 20 مل من محلول حمض الخليك. اضبط الرقم الهيدروجيني على 5.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 10 مولار. ثم قم بتوزيع 500 ميكرولتر من محلول الشيتوزان في أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية.
أضف الآن اثنين وثلاثة وأربعة وخمسة ميكروغرامات من بلازميدات ABE في أنابيب فردية. قم بإذابة البلازميدات في 500 ميكرولتر من 30 ملليمولار من كبريتات الصوديوم. ثم اخلطي 500 ميكرولتر من محلول البلازميد مع 500 ميكرولتر من محلول الشيتوزان في الأنابيب المقابلة.
احتضن الأنابيب في حمام مائي على حرارة 50 إلى 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. قم بتدوير كل أنبوب لمدة 15 إلى 30 ثانية واتركه دون إزعاج لمدة 30 دقيقة. للتوصيف ، قم بتحليل قطر وإمكانات زيتا للشيتوزان باستخدام تشتت الضوء الديناميكي.
حافظ على تركيز الشيتوزان عند 0.1 ملليغرام لكل مليلتر في الماء المقطر المزدوج. بعد ذلك ، قم بإلقاء 0.1 ملليغرام لكل مليلتر من عينات الشيتوزان على شريحة سيليكون. أضف 20 ميكرولتر من العينات المعلقة إلى 200 شبكة شبكية واحتضنها.
معلق خلايا نخاع العظم بالطرد المركزي عند 800 جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية ، ثم أضف 500 ميكرولتر من محللة خلايا الدم الحمراء. بعد دقيقة ، أضف مليلترا واحدا من المخزن المؤقت للفصل لإيقاف التفاعل.
ثم احسب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا. بعد ذلك ، انقل مليون خلية إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد. بعد الطرد المركزي مرة أخرى ، قم بإخراج المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS.
انقل الخلايا المعلقة إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي وقم بقياس كفاءة التعداء باستخدام قياس التدفق الخلوي. لحقن تجويف نخاع العظم ، قم بتثبيت الفأر المخدر في وضع ضعيف على طاولة العمليات. استخدم شريطا لاصقا لتثبيت الطرف الأمامي في مكانه.
تطهير الظنبوب الخلفي باستخدام مسحة كحولية. ثم قم بتحميل محلول البلازميد في حقنة سعة ملليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 26. قم بإزالة أي فقاعات هواء واحتفظ بالمحقنة جاهزة للحقن.
بعد ذلك ، المس ساق الماوس وثبته بأصابعك. ضع إبرة الحقن لدخول عمود الظنبوب من هضبة الظنبوب بالقرب من مفصل الركبة. الآن قم بتدوير الإبرة بالتوازي مع الظنبوب ، وأدخلها في تجويف نخاع العظم وحقنها ببطء على مدى ثلاث ثوان.
بعد الحقن ، اسحب الإبرة ببطء على مدى ثلاث ثوان. قم بتطهير موقع البزل على الفور باستخدام مسحة كحولية لوقف أي نزيف. ضع الماوس في بيئة دافئة عند 37 درجة مئوية لتسهيل تعافيه.
الجسيمات النانوية المتكونة من بلازميدات ABE و GRNA لها مورفولوجيا كروية موحدة وتوزيع ضيق الحجم بمتوسط حجم 202.9 نانومتر. جهد زيتا 2.77 ملي فولت ومؤشر تشتت بولي 0.22. قام بلازميد ABE المضمن بالشيتوزان بتحسين إشارة الفلورسنت بشكل كبير في خلايا نخاع العظام مما يشير إلى كفاءة تعداء أعلى مقارنة بالمجموعة الضابطة.
أكد قياس التدفق الخلوي أن بلازميد ABE المشفر بالشيتوزان حقق كفاءة تعداء عالية في خلايا نخاع العظام. مع كفاءة قصوى تبلغ 51.2٪ لوحظت بجرعة أربعة ميكروغرام ، بينما وفرت ثلاثة ميكروغرامات توازنا من الكفاءة العالية بنسبة 47.2٪ تسلسل سانجر وتفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي الجيني لخلية نخاع العظم تم الكشف عنه في الجسم الحي في الموقع المستهدف A1 بكفاءة 14.27٪ وفي الموقع A2 بكفاءة 10.69٪.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لعلاج الجينات تعتمد على استخدام الكيتوزان لتوصيل البلازميدات القائمة على الأدينين مباشرة إلى نخاع العظام عن طريق الحقن داخل العظم. يهدف هذا النهج إلى تحسين كفاءة التلقيح وتعبير الجينات مع تقليل الضرر البيولوجي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- العلاج الجيني
- توصيل نخاع العظام
- تنشيط البلازميد
الخلفية
- يواجه العلاج الجيني تحديات مع كفاءة التلقيح المنخفضة.
- يمكن أن تعيق الاستجابات المناعية التعبير الجيني على المدى الطويل.
- الكيتوسان مادة متوافقة بيولوجيًا ومناسبة لتوصيل الأدوية.
- يرتبط ضعف وظيفة الخلايا العظمية المختلفة بالأمراض.
غرض الدراسة
- لتحسين توصيل البلازميدات إلى نخاع العظام.
- لتعزيز كفاءة تعبير الجينات في الخلايا المستهدفة.
- لتطوير طريقة مناسبة لعلاج الأمراض المرتبطة بالخلايا العظمية.
الطرق المستخدمة
- تغليف البلازميدات القائمة على الأدينين في الكيتوزان.
- حقن داخل العظم في نخاع عظام الفئران.
- تقييم كفاءة التلقيح والتأثير البيولوجي.
- تقييم مستويات التعبير الجيني مع مرور الوقت.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق كفاءة عالية في التلقيح مع ضرر بيولوجي بسيط.
- تمت ملاحظة تعبير جين هام في نخاع العظام.
- الطريقة فعالة للأمراض الناتجة عن ضعف وظيفة الخلايا العظمية.
- تظهر هذه الاستراتيجية إمكانية تطبيقات أوسع في العلاج الجيني.
الاستنتاجات
- يعتبر نظام التوصيل القائم على الكيتوزان نهجًا واعدًا للعلاج الجيني.
- يوفر الحقن داخل العظم طريقة مباشرة لاستهداف نخاع العظام.
- تفتح هذه الأبحاث طرقًا لعلاج اضطرابات جينية مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Efficient gene delivery to bone marrow remains a bottleneck in preclinical gene therapy and disease modeling, limiting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. The use of chitosan nanoparticles for intraosseous delivery of adenine base editor plasmids directly addresses transfection efficiency and immune evasion challenges. This approach enables robust in vivo gene editing, supporting translational continuity and risk-adjusted advancement in bone and osteoclast-related disease research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in bone marrow cells for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of osteoclast-related targets through efficient in vivo editing.
- Improves predictive confidence in disease-relevant gene modulation studies.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated bone marrow cell systems for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible and quantifiable transfection efficiency, supporting assay standardization.
- Enables reliable evaluation of gene editing outcomes via flow cytometry and sequencing readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for osteoclast dysfunction and bone pathology studies.
- Provides continuity from gene editing in discovery to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Reduces biological ambiguity in translational biomarker development for bone-targeted therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This intraosseous chitosan nanoparticle delivery method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, enabling direct gene editing in bone marrow for target validation and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in bone and osteoclast biology.
- Screening: Provides reproducible, quantitative transfection and editing metrics for assay readiness.
- Analytics: Enables flow cytometry and sequencing-based measurement of editing efficiency and gene expression.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation in disease-relevant bone models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for gene delivery and editing in bone marrow research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in bone-targeted gene studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible gene delivery to bone marrow cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in osteoclast and bone disease portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene therapy and disease model programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle formulation and intraosseous injection techniques.
- Needs access to flow cytometry, dynamic light scattering, and sequencing infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible transfection and editing assessment.
- Adaptation may be needed for different animal models or target tissues.
- Efficiency and immune response considerations must be evaluated for translational scalability.
