في الجسم الحي تطبيق وضع العلامات على القرب المستندة إلى TurboID في ذبابة الفاكهة السوداء

في هذه الدراسة ، يتم استخدام ملصقات القرب المستندة إلى TurboID لرسم خريطة لتفاعلات بروتينات الكوسة في خلايا السلالة الجرثومية للمبيض. تم تحديد كل من المتفاعلات المعروفة والجديدة للكوسة. والجدير بالذكر أنه تم العثور على العديد من التفاعلات الجديدة متورطة في طي البروتين ، وتنظيم الأغشية ، والاتجار المادي. في هذه الدراسة ، يتم استخدام TurboID لوضع العلامات الفعالة في الأنسجة الحيوانية مع التحكم في البيوتينيل في الخلفية. يتم تعزيز خصوصية الملصقات وتغطية البروتين من خلال تحسين الضوابط وإثراء الببتيدات الحيوية بعد التربسين. يتيح هذا النهج الفحص المنهجي لتفاعلات البروتين للكشف عن الوظائف والآليات الجزيئية للبروتينات ذات الأهمية.

[الراوي] للبدء ، ضع ملعقة مختبر من معجون الخميرة الناعم المحضرة عن طريق إذابة مسحوق الخميرة في الماء المقطر الثلاثي على جدار القارورة. خذ قارورة أخرى تحتوي على ذباب حديث الفقس واضغط عليها برفق لجمع الذباب في الأسفل. اقلب هذه القارورة على القارورة التي تحتوي على عجينة الخميرة وقم بمحاذاة الحواف لمنع الذباب من الهروب. اضغط على كلتا القواريرتين معا لنقل الذباب إلى الجزء السفلي من القارورة التي تحتوي على العجينة. بمجرد اكتمال النقل ، ضع أغطية قطنية بإحكام على كلتا القواريرتين وانتظر لمدة ثلاثة أيام. في اليوم الثالث ، قم بإعداد 100 محلول عمل ميكرومولار من البيوتين عن طريق تخفيف مخزون واحد من البيوتين المولي في الماء المقطر الثلاثي. أضف 500 ميكرولتر من حمض البروبونيك 0.5٪ إلى المحلول. اخلطي محلول البيوتين مع مسحوق الخميرة الجافة وقلبي حتى يصبح عجينة. أضف ملعقة مختبرية من معجون خميرة البيوتين إلى جدار قارورة طعام البيوتين. قسم الذباب إلى مجموعتين. انقل مجموعة واحدة إلى قارورة تحتوي على طعام عادي كعنصر تحكم. انقل المجموعة الأخرى إلى قارورة غذائية من البيوتين مكملة بمعجون خميرة البيوتين لبدء ابتهاج البيوتين. بعد 16 ساعة ، انقل الذباب إلى قارورة جديدة تحتوي على طعام عادي. لجمع ذبابة الفاكهة المبيض ، ضع ماصة ملليلتر واحد من وسط حشرات جريس البارد على طبق التشريح. باستخدام ملقط ناعم ، ضع ذبابة أنثى في طبق التشريح واغمرها في الوسط. امسك الصدر بزوج واحد من الملقط دون سحق الجسم. استخدم ملقطا آخر لإزالة طرف البطن الخلفي برفق حيث توجد الأعضاء التناسلية. اضغط ببطء على المبايض باستخدام الملقط ، بدءا من الجزء العلوي من البطن وتحرك لأسفل. قم بإزالة شباك العضلات والأنسجة المحيطة بها دون الإضرار بالمبايض. انقل المبايض النظيفة إلى أنبوب سعة 1.7 مل باستخدام ملقط وحافظ على الأنبوب على الثلج. لتحلل الأنسجة، أضف 500 ميكرولتر من كبريتات دوديسيل الصوديوم 2٪ في محابس محلول ملحي مكملة بكوكتيل مثبط للبروتياز في الأنبوب الذي يحتوي على المبايض. انتظر حتى يتم تحلل الخلايا ويصبح المحلول لزجا. قم بإجراء صوتنة باستخدام الشروط الموضحة على الشاشة. بعد ذلك ، لترسيب الأسيتون ، انقل المحللة إلى أنبوب ربط منخفض سعة خمسة ملليلتر. أضف الأسيتون البارد إلى الأنبوب بستة أضعاف حجم العينة. قم بدوامة الأنبوب لفترة وجيزة ، ثم قم بتحميله في دوار متعدد واحتضانه طوال الليل لمدة 16 ساعة تقريبا عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. حبيبات البروتينات المترسبة عن طريق الطرد المركزي عند 15,000 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. الآن ، أضف ملليلترين من محلول الخليط المكون من 90٪ من الأسيتون البارد و 10٪ يحاول محلول ملحي مخزن. امزج الحبيبات والمحلول عن طريق سحب العينة بحركة لأعلى ولأسفل. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة قبل تحميله مرة أخرى في الدوار المتعدد واحتضانه لمدة ساعتين عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. حبيبات البروتينات المترسبة عن طريق الطرد المركزي عند 15,000 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بإجراء دوران عند أربع درجات مئوية. ثم افتح الأنبوب واترك الحبيبات تجف في الهواء لمدة 10 دقائق. أعد تعليق حبيبات البروتين في 500 ميكرولتر من ثمانية مولي اليوريا. انقل المحلول إلى أنبوب ملي بحجم مليلتر واحد يحتوي على صوتيات مركزة تكيفية أو ألياف AFA. قم بإجراء صوت الأنبوب باستخدام نفس المعلمات الموضحة سابقا قبل إجراء حمض البيسنشونيك ، أو BCASA ، لتحديد تركيز البروتين. قم بتغيير طبيعة البروتينات باستخدام كتلة حرارية مضبوطة على 450 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. أضف خمسة ميكرولترات من ديثيوثريتول مولي واحد مذاب في ماء مقطر ثلاثي إلى الأنبوب لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 10 ملليمول. ضع الأنبوب مرة أخرى على الكتلة الحرارية لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية لتقليل البروتينات. أضف الآن 55 ميكرولترا من محلول اليودوأسيتاميد 400 مللي مولار في أنبوب العينة للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 40 ملليمولي قبل إعادة الأنبوب إلى الكتلة الحرارية للألكلة. خفف العينة بإضافة محلول بيكربونات الأمونيوم 50 ملليمولار حتى يصل الحجم الإجمالي إلى أربعة ملليلترات. أضف أربعة ميكرولترات من محلول مخزون كلوريد الكالسيوم المولي في الأنبوب للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ مليموليا واحدا. الماصة لأعلى ولأسفل لتجانس المحلول. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولتر من مليغرام واحد لكل مليلتر من محلول مخزون التربسين إلى الأنبوب ، مع الحفاظ على نسبة التربسين إلى العينة من واحد إلى 20. هضم البروتين باستخدام كتلة حرارية مضبوطة على 450 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية. اغسل 150 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المترافق مع الستربتافيدين لكل ثلاثة ملليغرامات من العينة مع ملليلتر واحد من اثنين من اليوريا المولية في محابس محلول ملحي. ماصة ملليلتر واحد من الببتيدات المهضومة في الأنبوب الذي يحتوي على الخرز وتخلط برفق. يمزج الخليط مع عينة الببتيد المتبقية في أنبوب ربط منخفض سعة خمسة ملليلتر. بعد الحضانة لمدة ساعة ، انقل ملليلترا واحدا من الخليط إلى أنبوب سعة 1.5 مل وضعه على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. اغسل الخرزات مرتين بمليلتر واحد من اثنين من اليوريا المولية في بيكربونات الأمونيوم 50 ملليمولار ومرة واحدة بمليلتر واحد من الماء المقطر الثلاثي قبل وضع الأنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة أخرى والتخلص من المخزن المؤقت. بعد ذلك ، قم بإدخال 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت elucian في الأنبوب المحتوي على الخرزة ، واخلطه برفق ، وقم بإزالة الببتيدات باستخدام كتلة حرارية مضبوطة على 300 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق عند 60 درجة مئوية قبل وضع الأنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسي. الآن انقل الميلون إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر ، وتجنب أي خرز. العينة المملوءة جاهزة الآن للتجفيف واستخدامها في تحليل قياس الطيف الكتلي. يعرض هذا الشكل التصوير متحد البؤر وتحليل التفاعل البروتيني للكوسة V5 TurboID لتحديد البروتينات القريبة والمتفاعلة. كشفت الصور متحدة البؤر عن تعبير متداخل قوي بين الجينات المعدلة والبروتينات القريبة بعد معالجة تغذية البيوتين كما تم التقاطه بواسطة الجسم المضاد V5 والستربتافيدين المترافق Alexa Fluer 594 على التوالي. كشف تحليل الأنطولوجيا الجينية لبروتين الكوسة V5 TurboID عن بروتينات بيوتينيل غنية تشارك في طي البروتين بوساطة المرافق ، وتنظيم نظام الغشاء الداخلي ، وتنظيم النقل من الشبكة الإندوبلازمية إلى جهاز GGI.