الفحص الكيميائي المناعي المعتمد للتحديد الشامل لمستقبلات عامل نمو البشرة البشري 2 التي يتم إطلاقها من الخلايا والمرتبطة بها

نقدم شطيرة تم التحقق من صحتها ، ELISA ، باستخدام أجسام مضادة وحيدة النسيلة جديدة ، والتي تتيح القياس الكمي الدقيق للمجال خارج الخلية المرتبط بالخلايا والإفراج عنه من بروتين HER2 للخلايا المزروعة في المختبر وعينات المرضى.

يعالج البروتوكول الحاجة إلى فحص دقيق ومعتمد لربط تركيز بروتين HER2 المتداول مع المظاهر السريرية للمرض في التشخيص والبحث.

قد يفتح نطاق العمل الواسع للمقايسة وتنوع أنواع العينات وموثوقية النتائج فرصا جديدة لإجراء تحليل شامل لحالة المستقبلات في النماذج المختبرية وفي الجسم الحي.

سيتم استخدام ELISA المطورة لقياس HER2 المنبعث من الأنسجة السرطانية في إفرازات مختلفة لجسم الإنسان مثل الدم أو السوائل البريتونية أو المخاط.

[مدرب] للبدء ، افصل الخلايا باستخدام التربسين بعد أن تصل إلى 80٪ من التقاء وجمعها في أنبوب مخروطي منفصل سعة 15 مل. بعد عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الأوتوماتيكي والبذور ثلاث مرات 10 إلى قوة خمس خلايا لكل بئر في صفيحة 12 بئر مع مليلتر واحد من وسط النمو. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. من ثقافة 24 ساعة ، اجمع وسط الثقافة من بئر واحد من كل خط خلية في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. قم بالطرد المركزي للعينات التي تم جمعها عند 10,000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد للتخزين عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. اغسل الخلايا المتبقية في كل بئر بمليلتر واحد من PBS البارد ، واستنشق برفق وتخلص من PBS. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA ، مع استكمال مثبط البروتياز بنسبة 1٪ لكل بئر واحتضانه لمدة خمس دقائق. الآن ، اكشط الخلايا باستخدام مكشطة خلية واخلط المحللة عن طريق سحب العينات عدة مرات للتجانس. اجمع الخلايا المحللة في أنبوب جديد واستنشق العينة ببطء في حقنة سعة ملليلترين مزودة بإبرة قياس 21 مقاس 0.8 × 40 ملم. بعد الشفط من خمس إلى 10 مرات ، قم بالطرد المركزي للعينات التي تم جمعها عند 10,000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد للتخزين عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. قم بتخفيف الجسم المضاد المضاد لالتقاط HER2 إلى ميكروغرام واحد لكل مليلتر في مخزن الترميز. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الملتقطة إلى كل بئر من لوحة ELISA سعة 96 بئرا. قم بتغطية اللوحة بغشاء مانع للتسرب. احتضان الطبق طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، ضع اللوحة في درجة حرارة الغرفة على شاكر أفقي لمدة ساعة واحدة. باستخدام غسالة صفيحة دقيقة ، قم بشفط محلول الطلاء وغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام 300 ميكرولتر من PBST. بعد ذلك، باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 5٪ من الحليب الجاف الخالي من الدسم في PBS إلى كل بئر مغلف لمنع مواقع الربط غير المحددة. الآن ، قم بإعداد منحنى المعايرة والتحكم الإيجابي. أضف ميكرولترين من مليغرام واحد لكل مليلتر ، محلول مخزون HER2 إلى 1,998 ميكرولتر من PBS لإنشاء 1000 نانوجرام لكل مليلتر معيار عمل. بالنسبة للمعيار الثاني ، أضف 500 ميكرولتر من المعيار إلى 500 ميكرولتر من PBS واخلطه جيدا لتحقيق 50 نانوجرام لكل تركيز مليلتر. قم بإعداد التخفيف التسلسلي لإنشاء المعايير من الثالث إلى السابع. بعد ذلك ، قم بإعداد عينات مصفوفة باستخدام محللات الخلايا PBS ووسط الاستزراع المسننة بتركيزات HER2 المعروفة. تحلل الخلايا المخففة من واحد إلى 2000 مع 2.5 ميكرولتر من المحللة وخمسة ملليلتر من PBS للحصول على مستويات HER2 أقل من حد الكشف. لتحضير محلول نانوغرام لكل مليلتر ، أضف ثمانية ميكرولتر من واحد قياسي إلى 392 ميكرولترا من وسط ثقافة PBS أو محللة الخلية واخلطها جيدا. باستخدام ماصة أحادية القناة، أضف 100 ميكرولتر من معايير PBS فارغة واختبر عينات كل منها ثلاث نسخ في آبار كل منها من لوحة ELISA المطلية والمسدودة. بعد ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في غرفة الرطوبة ، اغسل اللوحة باستخدام غسالة صفيحة دقيقة. للكشف عن ارتباط الأجسام المضادة ، قم بتخفيف الجسم المضاد للكشف عن البيوتينيل في PBS إلى تركيز عمل قدره ميكروغرام واحد لكل مليلتر. بعد ذلك، باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة للكشف إلى كل بئر. بعد ذلك ، قم بتخفيف AVID و HRP المترافق من واحد إلى 40,000 في 40 مل من PBST. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر من المترافق المخفف إلى كل بئر. بعد احتضان اللوحة وغسلها ، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 100 ميكرولتر من ركيزة 3،3 5،5 رباعي ميثيل بنزيدين إلى كل بئر لبدء التفاعل المتري اللوني. ثم قم بتغطية اللوحة بغشاء مانع للتسرب. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى خمس دقائق ، مع حمايتها من الضوء أثناء مراقبة تطور اللون. عند الوصول إلى شدة اللون المطلوبة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف إلى كل بئر لإنهاء التفاعل. أخيرا ، قم بقياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة. باستخدام منحنى معايرة رباعي المعلمات ، احسب تركيز العينة بناء على معادلة المنحنى. أظهرت الشطيرة المطورة ، ELISA ، نطاق عمل لبروتين HER2 من 1.56 إلى 100 نانوجرام لكل مليلتر مع معامل تحديد واحد يشير إلى مطابقة ممتازة. زاد تركيز HER2 في وسط المزرعة بمرور الوقت لجميع خطوط الخلايا المختبرة بأعلى القيم في 72 ساعة. أظهرت خلايا SK-OV-3 و SK-BR-3 تركيزات HER2 أعلى بمقدار عشرة أضعاف و 50 ضعفا تقريبا ، على التوالي ، مقارنة بخلايا MDA-MB-231 في وسط المزرعة في 24 ساعة. وبالمثل ، كانت مستويات HER2 في المحللات أعلى بحوالي ثلاثة أضعاف وخمسة أضعاف ل SK-OV-3 و SK-BR-3 ، على التوالي. ومن المثير للاهتمام أن وسط زراعة الخلايا احتوى على تركيزات أقل بمقدار 1000 ضعف من المستضد المختبر مقارنة بالبروتين المرتبط بالغشاء الموجود في محللات الخلية بأكملها.