التعديل الأنزيمي وتقييم قياس التدفق الخلوي للبروتينات المعروضة على سطح الخميرة

يركز هذا البحث على دراسة التعديلات الكيميائية للبروتينات التي تملي كيفية تصرف الخلايا. في هذه الحالة ، الهدف هو فهم تفضيلات وحركية الإنزيمات التي تعدل مجموعة متنوعة من الركائز.

تم إثبات القدرة على إزالة الفسفرة من جزيء الركيزة المعروض على سطح الخميرة لأول مرة. تفتح هذه النتيجة إمكانيات لرسم خرائط حركية قابلة للتعميم للتعديلات الأنزيمية التي لم يكن من الممكن الوصول إليها من قبل. يتناول هذا البحث التحديات المرتبطة بفهم تفاعلات ركيزة الإنزيم. عادة ما تكون محللات الخلايا أو الببتيدات المخصصة مطلوبة لهذا النوع من التقييم. هنا ، يتم توفير بديل FasL من خلال استخدام ركائز معروضة بالخميرة.

يعمل هذا البروتوكول على تطوير عرض سطح الخميرة التقليدي نحو تحليل ما يمكن أن يكون عادة تفاعلات إنزيمية داخل الخلايا في الفضاء خارج الخلية ، مما يتيح تحليل FasL لهذه التفاعلات التي يصعب تقييمها عادة.

يتيح هذا البروتوكول القدرة على استجواب تفضيلات الركيزة لمجموعة متنوعة من الإنزيمات من خلال طرق عالية الإنتاجية وإجراء دراسات حركية بقراءة بسيطة.

[مدرب] للبدء ، قم بإذابة جزء من خلايا الخميرة المحضرة على الجليد. أضف 0.5 إلى 1.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد الذي يحتوي على بناء عرض الخميرة مباشرة إلى الخلايا. ثم أضف 0.5 مل من محلول التحويل أو محلول بولي إيثيلين جلايكول معقم بنسبة 50٪ ومحلول أسيتات الليثيوم 0.1 مولار. اجمع خليط الخلايا والحمض النووي البلازميد ومحلول التحويل عن طريق سحب العينات. احتضان خليط التحويل بشكل ثابت لمدة 30 إلى 60 دقيقة عند 30 درجة مئوية ، وقم بتدوير الخليط على فترات 15 دقيقة. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1000 جرام. قم بإعداد أنبوب ثقافة سعة 14 مليلتر مع 4.5 مل من نمو خلايا الخميرة المحتوية على البلازميد ، أو وسائط SDCAA. أعد تعليق الخلايا التي تحتوي على البلازميد المطلوب في 500 ميكرولتر من SDCAA وتلقيح 4.5 مل من الوسائط المحضرة. وزع 50 ميكرولترا من خمسة ملليلتر من الثقافة الملقحة على لوحة SDCAA بعناية دون ثقب المثقاب. احتضان بشكل ثابت عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لتحديد كفاءة التحويل. الآن ، احتضن خمسة ملليلتر من ثقافة خلايا SDCAA في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة على الأقل. راقب الكثافة البصرية عند 600 نانومتر بعد 16 ساعة ، وكرر مرة أخرى بعد 20 ساعة. بمجرد أن تصل العينة إلى كثافة بصرية لا تتجاوز ستة ، قم بالطرد المركزي للثقافة لمدة ثلاث دقائق عند 2500 جرام ، وتخلص من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخميرة. أعد تعليق حبيبات الخميرة في تحريض تعبير البروتين ، أو وسائط SRGCAA ، إلى كثافة بصرية نهائية عند 600 نانومتر أقل من واحد. احتضان استزراع الخميرة في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة لمدة ثماني ساعات على الأقل ، ولكن ليس أكثر من 24 ساعة. ثم قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر لتحديد كثافة الخلية. قم بإعداد مخزن مؤقت العمل للعينات عن طريق تخفيف محلول عازلة العمل 2X بنسبة واحد إلى اثنين بالماء منزوع الأيونات في قارورة سعة 1.7 ملليلتر. أضف الحجم المناسب من ثقافة الخميرة المطلوبة لاستعادة مليوني خلية خميرة في قارورة سعة 1.7 ملليلتر لكل عينة. قم بالطرد المركزي للقارورة لمدة دقيقة واحدة عند 4500 جم ، وباستخدام ماصة دقيقة ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية والتخلص منها كنفايات خطرة بيولوجيا. أعد تعليق الخلايا المحببة في مليلتر واحد من PBSA قبل تكرار الطرد المركزي وإزالة المواد الطافية. اتركه جانبا. تحضير محلول SHP-2 البشري المؤتلف بتركيز نهائي قدره 1,000 نانومول في حجم تفاعل إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر. بعد ذلك ، أضف 7.7 ملليغرام من DTT إلى 10 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر لإنشاء محلول DTT سعة خمسة ملليمول. الآن ، خذ الخلايا المحببة وأعد تعليقها في المخزن المؤقت العامل بحيث يكون حجم التفاعل النهائي 20 ميكرولترا لكل عينة. أضف ميكرولترين من محلول DTT سعة خمسة ملليمولار إلى كل عينة للحصول على تركيز DTT نهائي يبلغ 0.5 ملليمول. أضف الحجم المحضر من SHP-2 إلى كل عينة لتحقيق حجم نهائي يبلغ 20 ميكرولترا، واخلطه برفق باستخدام ماصة دقيقة. لف أغطية قارورة العينة ب Parafilm لمنع التسرب أو التلوث المتبادل. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على دوار بسرعة ثابتة. بعد إزالة العينات من الدوار ، أوقف التفاعل عن طريق إضافة مليلتر واحد من PBSA إلى كل عينة قبل طردها مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة. ثم تخلص من الطافف. أعد تعليق العينات المحببة في مزيج سعة 20 ميكرولتر من الكواشف الأولية المقابلة لها ، واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 20 دقيقة ، قم بأخذ عينات من أجهزة الطرد المركزي عند 4500 جرام لمدة دقيقة واحدة وتخلص من المادة الطافية كنفايات خطرة بيولوجيا. اغسل الخلايا مرة واحدة عن طريق إعادة تعليقها في مليلتر واحد من PBSA قبل الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى. الآن ، أعد تعليق العينات في مزيج سعة 20 ميكرولتر من الكواشف الثانوية المقابلة لها ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة في الظلام. بعد الطرد المركزي للعينات والتخلص من المادة الطافية ، اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام PBSA قبل طردها مرة أخرى. بعد ذلك ، أعد تعليق العينات المغسولة في 300 إلى 500 ميكرولتر من PBSA ، وانقلها إلى أنابيب البوليسترين سعة خمسة ملليلتر لتحليل قياس التدفق الخلوي. بعد تحضير مقياس الخلوي ، انقر فوق ملف ، متبوعا بزر تجربة جديدة ، قم بتسمية التجربة وانقر فوق حفظ لضمان حفظ البيانات التي تم الحصول عليها في مسار الملف المطلوب. حدد أيقونة المخطط النقطي في شريط الأدوات العلوي لإنشاء مخططين نقطيين أو أكثر لكل عينة. بالنسبة لإحدى المخططات النقطية، تأكد من أن اسم المحور x يعرض قناة FSCA، وأن اسم المحور y يعرض قناة SSCA. بالنسبة لمخطط آخر، حدد اسم المحور x لعرض القناة التي يتألق فيها الكاشف الثانوي الذي يستهدف الجسم المضاد لعلامة الأحتمة الأولية، واسم المحور y لعرض القناة التي يتألق فيها الكاشف الثانوي للستربتافيدين. قم بتوفير اسم وصفي للعينة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الأنبوب، وتحديد تحرير الاسم وإدخال اسم العينة. ضع كل أنبوب عينة في حامل مقياس الخلويات، وانقر فوق تشغيل لبدء تحميل العينة والحصول على البيانات. اضبط الأحداث والوقت ومعدل التدفق حسب الضرورة. حدد بوابة تحيط بخلايا الخميرة السليمة في مخطط SSCA مقابل FSCA. ثم سجل مضان جميع عينات التحكم. حدد استراتيجية بوابات للمؤامرة التي تم إنشاؤها قبل تحليل العينات المعالجة. سجل تألق العينات منزوعة الفسفرة باستخدام مقياس الخلوي واستراتيجية البوابات قبل تحليل البيانات باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي. قم بتقييم الفسفرة عن طريق قياس ومقارنة متوسط المحور y للخلايا التي تعبر عن البروتين على سطحها ، والفسفرة الأساسية التي توفرها الخلايا غير المشغلة بين العينات والضوابط. أخيرا ، احسب النسبة المئوية لفرق الفسفرة الوسيط باستخدام الصيغة المقدمة. يوضح هذا الشكل تأثير تركيزات الفوسفاتيز المتغيرة SHP-2 وأوقات الحضانة على متوسط فرق الفسفرة في ركائز الخميرة المعروضة على سطح الخميرة. انخفض الاختلاف في متوسط الفسفرة بمرور الوقت عبر جميع تركيزات SHP-2 ، مع أعلى إزالة من الفسفرة لوحظت عند تركيز 1,000 نانومولار SHP-2 في أربع ساعات. بعد ساعتين من الحضانة ، نتج عن 1,000 نانومولار SHP-2 ما يقرب من 48.8٪ من متوسط فرق الفسفرة ، وهو أقل بكثير من حالة 750 نانومولار في نفس النقطة الزمنية. لم يلاحظ فرق يعتد به في متوسط فرق الفسفرة عندما تم تمديد الحضانة من ساعتين إلى ثلاث ساعات عبر تركيزات SHP-2 500 نانو و 750 نانومولار و 1,000 نانومولار.