تحضير الأنسجة السليمة للتحليل المجهري لطبقة خلايا السويداء في بذور نبات الأرابيدوبسيس النامية والناضجة

أحد مجالات بحثنا هو علم البذور. نهدف إلى الإجابة على سؤال حول كيفية مساهمة السويداء في إنبات البذور. كشف اختبار في المختبر يسمى مقايسة تثبيط نمو البذور عن الأهمية الفسيولوجية للذذاء في إنبات البذور. بذور نبات الأرابيدوبسيس صغيرة جدا ، وموقع الطبقة الخلوية السويداء أسفل الخصية ، وهي الخلايا. من الصعب تحضير عينات السويداء دون التثبيت الكيميائي. استخدم التحليل السابق لتحليل السويداء عينات ثابتة كيميائيا ، لذلك لم يتمكنوا من مراقبة حركة بروتينات الكائن الحي. يتيح بروتوكولنا تصوير خمس خلايا لديناميكيات خلايا السويداء. يمكن تنفيذ بروتوكولنا باستخدام معدات مختبرية قياسية ويتيح رؤية أعمق للأحداث بين الخلايا وآليات الجزيئات ووظيفة السويداء العادية.

[الراوي] للبدء في زراعة نباتات نبات الأرابيدوبسيس على التربة أو الصوف الصخري حتى مرحلة الإزهار. ضع علامة على الزهور المفتوحة بالكامل بخيوط ملونة للإشارة إلى صفر أيام بعد الإزهار. حدد السيليك من 12 إلى 16 يوما بعد الإزهار للإجراء التالي. باستخدام مقص ناعم ، قم بقطع السيليكات النامية الملحوظة عند العنق واجمعها في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر. قم بإعداد ورق ترشيح مبلل للتشريح لمنع الجفاف ووضع العينة تحت مجهر استريو. باستخدام ملقطين ، أحدهما بأطراف سميكة للإمساك والآخر بأطراف حادة للتمزيق. افصل صماما عن البرقوق. ثم باستخدام الملقط مع إغلاق الأطراف ، التقط البذور النامية برفق من السيليكات لتجنب إتلافها. عند استخدام إبرة حقن قياس 27 ، قم بإنشاء ندبة بحجم 0.1 إلى 0.2 ملم تقريبا على الخصية والسويداء المحيطة بالجنين. امسك البذرة بالملقط دون سحقها واصنع الندبة عند تقاطع الفلقات والجذرية. الآن ، ادفع الجنين للخارج عن طريق قرص البذرة بالملقط ، مع الحرص على عدم سحق غلاف البذور والحفاظ على شكله الدائري. أدخل إبرة الحقن في غلاف البذور الفارغ عند الندبة واثقبها من الداخل إلى الخارج. بعد ذلك ، احتفظ بالإبرة في مكانها واستخدم ملقطا مغلقا لخدش سطح Testa. ثم قم بقص جانب واحد من غلاف البذور للسماح له بالفتح. الآن باستخدام ملقط حاد ، افتح مغلف البذور في ورقة. يجب أن تكون العينة المعزولة الآن عبارة عن صفيحة ثنائية الطبقة تتكون من السويداء والتيستا. ضع بذور نبات الأرابيدوبسيس الجافة في أنبوب سعة 1.5 مل وأضف ملليلتر واحد من الماء المقطر المزدوج إليها. احتفظ بالبذور مشببة لمدة 40 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد ورق ترشيح مبلل على مسرح المجهر الاستريو للتشريح وباستخدام ماصة دقيقة سعة 1000 ميكرولتر ، انقل البذور المشببة إلى ورق الترشيح الرطب. الآن ضع العينة تحت مجهر استريو. باستخدام إبرة حقن ، اصنع ندبة بحجم 0.2 ملم تقريبا على الخصية والسويداء المحيطة بالجنين. امسك البذرة بالملقط دون سحقها ، واستهدف التقاطع بين النبتة والجذور للندبة. الآن ادفع الجنين للخارج بعد قرص البذرة بالملقط. تجنب سحق غلاف البذور الفارغ والحفاظ على شكله الدائري. باستخدام إبرة حقن ، قم بقص الجانبين العلوي والسفلي من غلاف البذور الفارغ لتشكيله في شكل أسطواني. بعد ذلك ، قم بقص غلاف البذور الأسطواني على طول محوره المركزي لتقسيمه إلى قطعتين. يجب أن تكون النتائج صفائح ثنائية الطبقة مصنوعة من السويداء والخصية. ضع عينات السويداء المعزولة على شكل صفائح على شريحة زجاجية وقم بتثبيتها في الماء. أخيرا ، ضع غطاء برفق فوق العينة للتأكد من أن طبقة السويداء متجهة لأعلى باتجاه زلة الغطاء. استخدم طلاء الأظافر أو الشحوم لإغلاق حواف انزلاق الغطاء ومنع الجفاف قبل مراقبة العينة تحت المجهر. تم تصور العديد من خلايا السويداء وهياكلها داخل الخلايا بنجاح من البذور التي تم حصادها بعد 14 يوما من الإزهار باستخدام بروتوكول التحضير المعمول به. تم الكشف عن أجسام مصورة داخل نواة خلايا السويداء ، معبرة عن PHYB-GFP تحت الضوء الأبيض ، مما يؤكد وجودها وتوطينها النووي. أظهرت خلايا السويداء تكوينا ضوئيا للجسم عند التعرض للضوء الأحمر والأحمر بالتناوب مما يؤكد انعكاس صور PHYB والنشاط البيولوجي حتى 4.5 ساعة بعد التشريح. تم إجراء التصوير بفاصل زمني فلوري للميتوكوندريا في خلايا السويداء السليمة بعد ثلاث ساعات من تثبيط البذور وتم الكشف عن حركة الميتوكوندريا. لوحظت حركة أكثر ديناميكية للميتوكوندريا في خلايا السويداء بعد يوم واحد من تثبيط البذور ، مما يشير إلى زيادة النشاط بمرور الوقت.