نقل واسع النطاق للخلايا العصبية القشرية الحديثة للفأر عن طريق الحقن تحت العنكبوتية ل AAV2

يركز بحثنا على تطوير الطريقة التي تسمح بالنقل الفيروسي لحجم كبير من الأنسجة العصبية في القشرة المخية الحديثة للفأر. عادة ، يتم حقن تعليق الجزيئات الفيروسية مباشرة في حمة الدماغ. هنا يتم تحديد تعداء المنطقة عن طريق انتشار الجسيمات الفيروسية في أنسجة المخ ، والتي لها نطاق محدود.

نقوم بحقن فيروسات ناقلة فيروسية AAV2 في الفضاء تحت العنكبوتية عبر سطح الدماغ. وجدنا أن إعطاء الفيروس تحت العنكبوتية أدى إلى زيادة أربعة أضعاف تقريبا في منطقة العدوى مقارنة بالحقن داخل المتنة. توفر التقنية الجديدة تنبيحا واسع النطاق للخلايا العصبية القشرية الحديثة في الفئران البالغة ، وتساعد في الحفاظ على أنسجة المخ للتسجيلات البصرية أو الفيزيولوجية الكهربية اللاحقة للنشاط العصبي.

تسمح طريقة الحقن الخاصة بنا بالتعبير الانتقائي للجينات المحورة في طبقة سكانية كبيرة من خمسة خلايا عصبية هرمية ، حتى عند استخدام محفز قوي غير انتقائي. ومع ذلك ، فإن آلية هذه الانتقائية ليست مفهومة تماما. للبدء ، قم بتأمين الأسنان الأمامية لفأر مخدر في شريط الأسنان ، وقم بتركيب قناع.

ضع الماوس بعناية على قضبان الأذن. احلق الرأس من العينين إلى خلف الأذنين ، ثم امسح السطح المحلوق بنسبة 70٪ إيثانول ، متبوعا بمحلول كحول 5٪ من اليود. ضع محلول ليدوكائين معقم 4٪ موضعيا ، وحقن 0.02 مل من ديكساميثازون تحت الجلد لتقليل الألم والالتهابات.

باستخدام مشرط ومقص معقم ، قم بعمل شق خط الوسط من أربعة إلى خمسة ملليمترات يبدأ بين الأذنين لفتح فروة الرأس. قم بتوسيع الشق باستخدام المقص لتجنب تلف الجمجمة. امسح سطح الجمجمة ببيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ لتصور بريجما ولامدا.

أوقف التفاعل على الفور مع محلول ملحي من كلوريد الصوديوم 0.9٪. ثم استخدم مكشطة العظام لإزالة الأنسجة من سطح الجمجمة. قم بتركيب الحاقن الآلي المعد مسبقا بحقنة هاميلتون على الذراع التجسيمية.

قم بإضاءة الجمجمة المكشوفة باستخدام مصدر ضوء جراحي وركز المجهر على بريجما. بالنظر من خلال المجهر ، قم بمعالجة الذراع التجسيمية لمحاذاة طرف الإبرة مباشرة فوق بريجما. قم بمحاذاة البريجما واللامدا أفقيا باستخدام طرف الإبرة.

ارجع إلى bregma وسجل الإحداثيات. حرك الإبرة إلى الإحداثيات المحسوبة. قم بخفضه إلى الموضع الجديد وقم بتمييزه.

حدد موقع الحقن الفيروسي بالقرب من الهدف مع التفكير في انتشار الفيروس. الآن ، استخدم نتوءا معقما للأسنان بقطر 0.5 إلى 0.8 ملم لإنشاء بضع قحف صغير أثناء المشاهدة من خلال المجهر. استخدم الهواء المضغوط لتفجير غبار العظام.

اغسل الحفرة بمحلول ملحي معقم وقم بإزالة الفائض بقطعة قطن. ثم استخدم إبرة قياس 27 بطرف على شكل خطاف أو ملاقط رفيعة لإزالة العظام المتبقية ، مع الحرص على عدم إتلاف الجافية. غطي الجمجمة بمنشفة ورقية معقمة مبللة بالمحلول الملحي.

ثم ضع طبقة شفافة معقمة فوق سطح الجمجمة. حرك الذراع التجسيمية للخلف وقم بمحاذاة إبرة المحقنة الصغيرة فوق الفيلم الشفاف. ثم تخلص من الزيت الزائد حتى يتبقى ميكرولتر.

ماصة حجم الحقن الفيروسي وميكرولترين آخرين من الفيروس على الفيلم الشفاف. بالنظر من خلال المجهر ، قم بخفض طرف الإبرة في وسط قطرة الفيروس. الآن قم بتحميل الفيروس في المحقنة الصغيرة باستخدام حاقن آلي.

قم بإزالة الورق المبلل من الجمجمة وجفف المنطقة بقطعة قطن. أعد وضع الذراع والإبرة التجسيمية فوق موقع الإدخال. بعد ذلك ، قم بتوزيع قطرة من الفيروس للتحقق من انسداد الإبرة.

اصنع شقا صغيرا في الجافية باستخدام إبرة قياس 30 بطرف على شكل خطاف. اخفض إبرة المحقنة إلى الجافية واحسب عمق الإدخال بناء على نقطة التلامس السطحية. أدخل الإبرة ببطء في القشرة على عمق 300 ميكرومتر ، وانتظر لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، ثم تراجع إلى 200 ميكرومتر وانتظر دقيقتين إلى ثلاث دقائق أخرى.

ابدأ الحقن الفيروسي بمعدل 0.06 ميكرولتر في الدقيقة بإجمالي ميكرولتر واحد. بعد التسريب ، احتفظ بالإبرة في الموقع المستهدف لمدة 10 دقائق للسماح بتشتت الفيروس. ثم اسحب الإبرة ببطء لتجنب التدفق العكسي.

قم بتوزيع قطرة من الفيروس للتأكد من عدم انسداد الإبرة. أغلق شق فروة الرأس باستخدام خيوط قابلة للامتصاص أو غير قابلة للامتصاص 5-0. أدى إعطاء AAV2 تحت العنكبوتية إلى مساحة أكبر بكثير من العدوى العصبية مقارنة بالحقن التقليدي داخل القشرة ، مع توسع بمقدار أربعة أضعاف تقريبا في كل من الاتجاهين الوسطي الوحشي والرجعي.

أدى حقن الفيروس تحت العنكبوتية إلى وضع علامات فلورية خضراء قوية على الخلايا العصبية في الطبقات القشرية الثانية والثالثة والخامسة ، بينما لم تظهر الطبقتان الرابعة والسادسة أي أجسام خلوية مصنفة ولكنهما عرضوا التشعبات والمحاور المرئية على التوالي. تم العثور على جزيئات الفلورسنت التي تمت إضافتها إلى معلق الفيروس المحقون أثناء الحقن تحت العنكبوتية على طول سطح الدماغ ، مما يشير إلى انتشار الفيروس عبر السائل النخاعي ، مع تغطية سطحية أوسع من وضع العلامات العصبية. أكد التوزيع السطحي الكبير للفلورة الخضراء في الأقسام الأمامية انتشار العدوى القشرية بعد الحقن تحت العنكبوتية ، على عكس العدوى الموضعية الصغيرة التي شوهدت بالحقن القياسي.

في الطبقات فائقة الحبيبات ، كان جزء كبير من الخلايا العصبية المنقولة يعبر عن بارفي ألبومين أو كالبيندين ، بينما لم يتم اكتشاف أي خلايا عصبية داخلية مشتركة في الطبقة الخامسة ، وتم تمثيل جميع الخلايا المصابة حصريا بواسطة الخلايا العصبية الهرمية.