تخليق الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة المركبة: نموذج محاكاة حيوية للخلايا النووية

تقدم هذه المقالة طريقة لتحضير الحويصلات العملاقة أحادية الصفيحة المركبة (cGUVs) بهيكل حويصلة في الحويصلة ، مع موصلية كهربائية مخصصة في المناطق الداخلية والحلقية والخارجية. يصنع التكوين الكهربائي GUVs البسيطة ، والتي تتحول إلى خلايا فعمية و cGUVs عبر الصدمة التناضحية ، مما يوفر نموذجا قيما لدراسة الفيزياء الحيوية للخلايا النواة.

لقد أجرينا دراسة مفصلة حول التخليق والديناميكا المائية الكهربائية للحويصلات أحادية الصفائح العملاقة المركبة لإثباتها كمكافئات مغناطيسية حيوية للخلايا حقيقية النواة. المحاولة هي فهم التقنيات التي تنطوي على تطبيق المجال الكهربائي على الخلايا البيولوجية مثل التثقيب الكهربائي للخلايا والتشوه الكهربائي للخلية.

يتم استخدام مزيج من الفحص المجهري الفلوري والضوئي ، والمعالجات الكهربائية النبضية النانوية ، وراسم الذبذبات ومصادر الطاقة ، وطرق التوليف المبتكرة للنهوض بالبحث في هذا المجال. التحدي في تخليق GUVs المركبة جيدة التكوين في حساسية الطريقة لدرجة الحرارة وأنواع الدهون والتركيبة المستخدمة. في هذا العمل ، نوضح ذلك لنظام DMPC والكوليسترول ، لكن تعميمه لا يزال يمثل تحديا. تم تصنيع GUVs البسيطة التي تحاكي الخلايا النووية في الأدبيات. نقوم بتصنيع الحويصلة العملاقة المركبة لمحاكاة الخلايا ذات النواة مع بنية دفاع الصمام ، مما يحيط بحويصلة داخلية بحوالي نصف حجم الحويصلة الخارجية.

سنركز على دراسة تأثير النبضات الدقيقة والنانوية الثانية على الحويصلة الداخلية ، وهي تقليد لنواة الخلية البيولوجية في سياق التثقيب الكهربائي.

[راوي] للبدء ، قم بتنظيف أكسيد القصدير الإنديوم أو الشرائح المطلية ب ITO جيدا باستخدام محلول صابون الأطباق ، واشطفها بالماء منزوع الأيونات بموصلية 0.055 ميكروسيمنز لكل سنتيمتر. ثم باستخدام محلول الإيثانول بنسبة 100٪ ، قم بتنظيف الشرائح مرة أخرى واشطفها بالماء منزوع الأيونات. جفف الشرائح في فرن على درجة حرارة 85 درجة مئوية. حدد الجانب الموصل لكل شريحة مطلية ب ITO باستخدام مقياس المشبك. قم بتثبيت الشريحة النظيفة على مرحلة مبرمج الدوران باستخدام مكنسة كهربائية ، مما يضمن أن الجانب الموصل متجها لأعلى. ضع 25 ميكرولتر من محلول الدهون ، واحدة أربع قطرات على الجانب الموصل لشريحة ITO واحدة. خذ شريحة أخرى وقم بتطبيق 25 ميكرولتر من محلول الدهون اثنين بنفس الطريقة. جفف كلتا الشرائح المطلية بالدهون بالمكنسة الكهربائية في مجفف مخزن في الظلام لمدة ساعتين على الأقل. ثم قم بترتيب شريحة ITO مطلية بالدهون مع شريحة دهنية بالتوازي مع شريحة نظيفة ، مما يضمن أن الجوانب الموصلة تواجه بعضها البعض ، وضع فاصلا من مطاط السيليكون بسمك ثلاثة ملليمترات بينهما. أغلق الإعداد بمشبك لإنشاء غرفة تشكيل كهربائي. الآن املأ الغرفة بمحلول السكروز 100 ملليمولار باستخدام حقنة سعة ملليلتر. قم بتوصيل كابل الإخراج الخاص بمولد الوظائف بالشرائح المطلية ب ITO باستخدام مولد الوظيفة. ضع غرفتي التشكيل الكهربائي في حاضنة محفوظة بين 38 و 40 درجة مئوية. تطبيق مجال كهربائي متناوب بتيار متردد يبلغ خمسة فولت من الذروة إلى الذروة بتردد 10 هرتز باستخدام مولد دالة ثنائي القناة لمدة أربع ساعات. بعد الحضانة ، افصل غرف التشكيل الكهربائي عن مولد الوظيفة. أخرجيها من الحاضنة واتركيها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. باستخدام حقنة ، احصد الحويصلات العملاقة أحادية الصفائح المركبة من كل غرفة وانقلها إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة سعة ملليلترين. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة بين 25 و 27 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل الشروع في الصدمة التناضحية. انقل 200 ميكرولتر من الحويصلات أحادية الصفائح العملاقة البسيطة ، أو sGUVs ، المعلقة في وسط مرطب يحتوي على محلول السكروز 100 ملليمولار إلى غرفة المراقبة ، وإدخال 125 ميكرولتر من محلول الجلوكوز 300 ملليمولار للحث على صدمة تناضحية وبدء انتقالات الشكل. اسمح ل sGUVs ، التي تخضع الآن لصدمة تناضحية ، بالراحة لمدة ساعة واحدة داخل غرفة المراقبة الموضوعة في مرحلة الفحص المجهري. قم بإجراء التباين والتداخل التفاضلي والفحص المجهري اللامضاق باستخدام مجهر مقلوب مزود بكاميرا أحادية اللون. استخدم مسافة العمل الطويلة جدا من Plan Fluor 20X × 0.45 و 40X × 0.60 عدسات موضوعية لمراقبة انتقالات الشكل في sGUVs. من أجل التألق ، استخدم مجموعة مرشح أخضر مع إثارة عند 510 إلى 560 نانومتر ، ومرآة ثنائية اللون عند 575 نانومتر ، ومرشح حاجز عند 590 نانومتر للطبقات الثنائية الملطخة باللون الأحمر Niall. مراقبة انتقالات الشكل داخل غرفة المراقبة باستخدام التباين التفاضلي والتباين والفحص المجهري اللامضاق باستخدام عدسات تخطيط فلور الموضوعية. راقب تكوين حويصلات الخلايا الفمية مع استمرار انتقال الشكل. راقب كيف تستقر الحويصلات الأكبر أولا ، تليها زيادة في عدد الحويصلات الأصغر بمرور الوقت. بعد ذلك ، أضف محلول الملح لضبط الموصلية في مناطق مختلفة من cGUVs قبل إحداث صدمة تناضحية. على سبيل المثال ، لإنشاء موصلية أعلى في المناطق الخارجية والداخلية من المنطقة الحلقية ، انقل 200 ميكرولتر من محلول السكروز إلى غرفة الصهر الكهربائي. أضف 20 ميكرولتر من محلول الملح 7.5 ملليمولار إلى الغرفة ، وقم بإحداث صدمة تناضحية ب 125 ميكرولتر من محلول الجلوكوز 300 ملليمولار. اترك sGUVs للصدمات التناضحية ترتاح في الغرفة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات. تأكد من أن cGUVs الناتجة لها موصلية أعلى في المناطق الخارجية والداخلية مقارنة بالمنطقة الحلقية. لإجراء التشوه الكهربائي ل cGUVs ، باعد بين أقطاب السلك 500 ميكرومتر ، وقم بتطبيق جهد كهربائي متناوب يبلغ 7.5 فولت من الذروة إلى الذروة عند 100 كيلو هرتز باستخدام مولد وظيفة. بعد تطبيق المجال الكهربائي ، التقط الفيديو بمعدل 10 إطارات في الثانية ، ولاحظ التشوه المفلطح للحويصلات الخارجية والتشوه التكويفي للحويصلات الداخلية. ثم قم بتحميل خليط cGUV في شريحة تجويف وأغلقه بزلة غطاء لمنع الحركة. استخدم مجهره متحد البؤر للمسح بالليزر لتحليل مورفولوجيا cGUV من خلال مسح المحور Z بحجم خطوة ميكرومتر واحد. استخدم عدسة موضوعية Plan Apochromat 40X × 1.3 OIL DIC للتصوير. استخدم وضع أحادي القناة أحمر مع إثارة 561 نانومتر وانبعاث من 561 إلى 695 نانومتر لتصوير cGUV ملطخ ب Niall Red أو Rhodamine PE. تعديل واستخراج ملف . ملف صورة CZI باستخدام البرنامج المرتبط بالمجهر. قم بإدراج رسومات مثل أشرطة المقياس ، وقم بتمكين طرق العرض ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد. ثم انتقل إلى طريقة المعالجة والمعلمات لضبط الإعدادات المطلوبة. ثم انقر فوق تطبيق لتصدير الصورة بتنسيق JPG. أخيرا ، افتح الملف في برنامج ImageJ. لإدراج شريط مقياس، انتقل إلى التحليل، متبوعا بتعيين المقياس للمعايرة، ثم حدد تحليل متبوعا بالأدوات وشريط المقياس لتطبيقه. أكد التصوير Z-stack متحد البؤر أن الحويصلات الداخلية قد تم فصلها تماما عن الحويصلات الخارجية ورفعت في المستوى Z بسبب انخفاض كثافة المحلول الداخلي. أظهرت حالة الخلايا الفمائية الوسيطة رقبة ضيقة تربط الحويصلات الداخلية والخارجية قبل الانفصال الكامل. لوحظ مجموعة متنوعة من الأشكال الحويصلية ، بما في ذلك الحويصلات الداخلية المتعددة والأجسام على شكل نجمة والهياكل الأنبوبية بعد ست ساعات من الصدمة التناضحية. تم تشكيل وفرة عالية من cGUVs باستخدام خليط دهني من 1،2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine والكوليسترول بنسبة 63 إلى 37 مولار. تحت مجال كهربائي متناوب ، أظهرت cGUVs تشوها مع تشكيل الحويصلة الخارجية شكلا مفلطحا وتشكل الحويصلة الداخلية شكلا مفلطحا.