<em>In Vivo</em> Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Trigeminal Ganglia

John Shannonhouse; Hyeonwi Son; Yan Zhang; Eungyung Kim; Deoksoo Han; Ruben Gomez; Joon Tae Park; Yu Shin Kim

doi:10.3791/68284

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للمجموعات العصبية في شبكات الخلايا العصبية الحسية الأولية ...

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Trigeminal Ganglia

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للمجموعات العصبية في شبكات الخلايا العصبية الحسية الأولية في العقد ثلاثية التوائم السليمة

Full Text

769 Views

07:55 min

August 1, 2025

DOI: 10.3791/68284-v

John Shannonhouse^1,2, Hyeonwi Son^1,2, Yan Zhang^1,2, Eungyung Kim^1,2, Deoksoo Han^1,2, Ruben Gomez^1,2, Joon Tae Park^2,3, Yu Shin Kim^1,2,4

¹Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry,University of Texas Health Science Center at San Antonio, ²Department of Endodontics, School of Dentistry,University of Alabama at Birmingham, ³Division of Life Sciences, College of Life Sciences and Bioengineering,Incheon National University, ⁴Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences,University of Texas Health Science Center at San Antonio

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study provides a detailed protocol for in vivo GCaMP calcium imaging of intact trigeminal ganglion (TG) neurons, focusing on the neural activation and responses to stimuli. The protocol includes surgical preparation, imaging techniques, and data analysis, enabling researchers to observe calcium transients in response to various sensory stimuli directly in vivo.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Calcium Imaging
Neurophysiology

Background

The trigeminal ganglion plays a crucial role in sensory perception, including pain, itch, and touch.
Studying neural networks in vivo is crucial yet challenging due to the complexity of physiological conditions.
Current research techniques often fail to capture the dynamic responses of neurons in real-time.
In vivo GCaMP imaging provides insights into neural activation at the population level during stimulation.

Purpose of Study

To develop a protocol for visualizing calcium transient activities in TG neurons during sensory stimulation.
To analyze how neurons respond to different types of stimuli.
To complement existing behavioral and cellular techniques with real-time imaging data.

Methods Used

In vivo calcium imaging using GCaMP in anesthetized mice.
Targeted dissection and exposure of the trigeminal ganglion for imaging.
Application of various stimuli (mechanical, thermal) during imaging sessions.
High-speed and high-resolution confocal microscopy protocols for capturing neuronal activity.
Data analysis includes ROI selection, intensity measurement of calcium transients, and statistical comparisons of neuron responses.

Main Results

The technique enabled visualization of spontaneous and stimulus-evoked calcium transients across V2 and V3 regions of the TG.
Higher intensity of calcium responses was recorded with increased mechanical stimulation.
Distinct neuronal activation patterns were observed with noxious thermal stimuli, revealing differences based on stimulation type and location.
Findings provide insights into the sensory processing mechanisms at the level of individual neurons within sensory ganglia.

Conclusions

This protocol advances the understanding of neuronal responses to sensory stimuli in vitro, highlighting the importance of in vivo imaging techniques.
The data collected can inform future investigations into pain mechanisms and sensory processing.
Overall, the study illustrates how advanced imaging can elucidate the roles of trigeminal neurons in sensory perception.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of this GCaMP imaging protocol?

This protocol allows for real-time observation of calcium dynamics in intact TG neurons, offering insights into sensory processing that are difficult to achieve with traditional methods.

How is the trigeminal ganglion accessed for imaging?

A surgical procedure is performed involving a cranial opening to properly expose the trigeminal ganglion without damaging surrounding tissue.

What types of stimuli are used during imaging?

The protocol includes mechanical stimuli via Von Frey filaments and thermal stimuli by applying heat or cold to specific regions.

What kinds of data can be obtained using this method?

Researchers can obtain data on calcium transients, spontaneous activity, and neuronal responsiveness to different types of sensory stimuli.

Can this method be adapted for other sensory ganglia?

Yes, the protocol can potentially be adapted for imaging other sensory ganglia, supporting broader studies on sensory processing.

What are the limitations of this imaging technique?

Challenges include maintaining physiological conditions during anesthesia and potential variations in response due to individual animal differences.

يصف هذا البروتوكول في الجسم الحي تصوير الكالسيوم GCaMP للخلايا العصبية العقدية ثلاثية التوائم السليمة (TG). يشمل هذا الوصف جراحة التعرض ل TG ، والتصوير المجهري متحد البؤر في الجسم الحي للخلايا العصبية TG ، وتطبيق المحفزات الجسدية أثناء التصوير المجهري لخلايا TG العصبية TG ، وتحليل بيانات تصوير الكالسيوم في الجسم الحي .

يركز هذا البحث على الشبكات العصبية للعقد الطرفية ، بهدف فهم الإشارات والتفاعلات بين الخلايا التي ينطوي عليها الألم والحكة والإحساس باللمس. تشعر الخلايا العصبية بالمحفزات ، لكن دراسة نشاطها في الجسم الحي في ظل الظروف الفسيولوجية العادية لا تزال صعبة للغاية. يسمح بروتوكولنا بدراسة التنشيط العصبي للعقدة ثلاثية التوائم على مستوى السكان مباشرة استجابة للمنبهات ، وهو أمر مهم من الناحية الفسيولوجية ، ولكنه يمثل تحديا كبيرا من الناحية الفنية.

تعمل البيانات التي ينتجها هذا البروتوكول كمكمل قوي للسلوك وثقافة الخلايا وبيانات الكيمياء المناعية ، مما يسمح بالتحقيق في الآثار الفورية للمنبهات أو الأدوية على العقدة بأكملها. للبدء ، ضع الماوس المخدر على وسادة تسخين للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية ، ثم ضع الرأس في قناع تجسيمي مع إمالة حوالي 15 درجة إلى اليسار. ضع مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف والتهيج.

بعد حلق الجانب الأيمن من رأس الفأر، قم بعمل شق مستطيل بطول تسعة ملليمترات في خمسة ملليمترات بين الأذن اليمنى والعين اليمنى. قطع الأنسجة على سطح الجمجمة فقط البطني للعين. أوقف أي نزيف باستخدام مسحة مرقئ أو مناديل معملية.

باستخدام مثقاب الأسنان وبر الشق المستدق ، قم بحفر ثقب حوالي تسعة ملليمترات × خمسة ملليمترات في الجمجمة الظهرية المتمركزة في موقع الشق. قم بإمالة الرأس حتى تظهر العقدة ثلاثية التوائم بوضوح. إذا كان هناك نزيف على العقدة ثلاثية التوائم ، فقم بشفط الدم أو إزالته باستخدام مسحة مرقئ أو مسح مختبري.

تأكد من أن العقدة ثلاثية التوائم مرئية بوضوح دون إزالة أي نسيج قشري. انقل ووسادة التدفئة إلى مرحلة المجهر. بعد التأكد من أن الفأر يتلقى تخديرا مستمرا من الأيزوفلوران ، ضع الإطار التجسيمي بحيث يكون هدف المجهر تسعة ملليمترات فوق فتحة الجمجمة مباشرة.

أدخل مقياس حرارة المستقيم وقم بتوصيل سلك الطاقة بمقياس الحرارة ووسادة التدفئة. استخدم هدفا 5X لتحديد سطح العقدة ثلاثية التوائم بالمجهر. اضبط الهدف ومخروط الأنف لتسطيح سطح العقدة وتعظيم مساحة السطح في المستوى البؤري.

الآن ، قم بتحميل بروتوكول المسح المجهري عالي السرعة المحدد. امسح العقدة ثلاثية التوائم في رشقات نارية قصيرة من ست إلى ثماني دورات. قم بتطبيق الإسقاطات المتعامدة لعمليات المسح الضوئي لإنشاء فيلم ، وتحقق من وضوح الصورة واتساقها بين الإطارات.

قم بتحميل بروتوكول المسح الضوئي عالي الدقة للمجهر وقم بإنشاء صورة عالية الدقة للعقدة ثلاثية التوائم. مرة أخرى ، قم بتحميل بروتوكول المسح عالي السرعة المستخدم لإنشاء فيلم العرض المتعامد وتسجيل النشاط التلقائي لمدة 80 دورة. قم بإنشاء الفيلم وتحقق من أن الصور واضحة ومتسقة بما يكفي للتحليل.

لتطبيق التحفيز ، اضبط المجهر على المسح الضوئي لمدة 15 إلى 20 دورة. بالنسبة لتحفيز فون فراي الذي يستهدف منطقة V2 من العقدة ثلاثية التوائم ، أمسك الفتيل وضعه بشكل متكرر على المنطقة المماثلة أسفل العين وفوق الفم من بعد الفحص 5 مباشرة حتى بعد الفحص 10 مباشرة. لتحفيز منطقة V3 ، ضع الفتيل بشكل متكرر على المنطقة المماثلة أسفل الأذن مباشرة أثناء نفس نافذة المسح.

للمنبهات الباردة والحرارة، قم بتبريد أو تسخين دورق من الماء إلى أقل بقليل من درجة الحرارة المطلوبة أو أعلىها. ابدأ المسح ، وبعد المسح 5 مباشرة ، استخدم ماصة نقل بلاستيكية لتطبيق المنبه الحراري على المنطقة المماثلة أسفل العين وفوق الفم لمنطقة V2 ، أو أسفل الأذن مباشرة لمنطقة V3. في نهاية التجربة ، قم بحقن 50 ملليمولار من كلوريد البوتاسيوم تحت الجلد في مناطق V2 أو V3 ، بدءا من الدورة 6 للتنشيط وتحديد جميع الخلايا العصبية المستجيبة.

افتح ملف الإسقاط المتعامد عن طريق سحبه وإفلاته في برنامج التحليل. حدد نوع الصورة بالنقر فوق صورة ، ثم النوع ، واختيار لون RGB. لفتح مدير عائد الاستثمار، انقر فوق تحليل، ثم أدوات، وحدد مدير عائد الاستثمار.

حدد الخلايا العصبية النشطة عن طريق رسم عائد استثمار باستخدام أداة القطع الناقص في شريط الأدوات. أضف كل منطقة محددة إلى ملف عائد الاستثمار بالنقر فوق الزر "إضافة" في نافذة مدير عائد الاستثمار. الآن ، انتقل إلى تحليل ، وحدد تعيين القياسات ، وحدد خيار متوسط القيمة الرمادية.

في نافذة مدير عائد الاستثمار، انقر فوق المزيد، ثم اختر القياس المتعدد لقياس الكثافة. عند فتح نافذة جديدة بعنوان النتائج، احفظ ملف CSV عن طريق تحديد ملف، ثم حفظ باسم. افتح ملف CSV في برنامج جدول بيانات، واحفظه كملف جدول بيانات. احسب شدة الكالسيوم العابرة باستخدام المعادلة المحددة.

للتحليل ، قم بأخذ عينات عشوائية من نفس العدد تقريبا من الخلايا العصبية من كل عقدة للتأكد من أن عقدة واحدة لا تهيمن على التحليل. قم بقياس قطر الخلايا العصبية باستخدام أداة الخط في شريط الأدوات لرسم خطوط على طول أطول وأقصر أقطار كل خلية عصبية. ثم احسب متوسط تلك القياسات.

مكن التصوير متحد البؤر للعقدة ثلاثية التوائم من التصور المتزامن لأكثر من 3,000 خلية عصبية ، والتقاط كل من الكالسيوم العابر التلقائي والمحفز عبر مناطق V2 و V3. في حالة عدم وجود تحفيز ، أظهرت مجموعة فرعية من هذه الخلايا العصبية عابرات الكالسيوم التلقائية مع ملامح نشاط مميزة عبر ست خلايا يتم تتبعها بشكل فردي. أدى تطبيق الحرارة الضارة على منطقة الفك العلوي إلى تنشيط مرئي للخلايا العصبية المتعددة ، كما يتضح من التألق الساطع مع الزيادات المتزامنة في شدة الكالسيوم العابرة.

أدت الحرارة الضارة المطبقة على منطقة الفك السفلي إلى تنشيط الخلايا العصبية المميزة بالمثل مع أنماط متغيرة من استجابات الكالسيوم عبر الخلايا الفردية. استجاب عدد أكبر بكثير من الخلايا العصبية لتحفيز فون فراي بمقدار جرامين مقارنة ب 0.4 جرام في منطقة V2. زادت شدة الكالسيوم العابرة في الخلايا العصبية الفردية بقوة أكبر مع تحفيز جرامين مقارنة ب 0.4 جرام ، مع ذروة أعلى وانتشار استجابة أوسع.

كان متوسط شدة استجابة الكالسيوم خلال إطار التحفيز الأول أكبر أيضا بشكل ملحوظ بعد تحفيز جرامين مقارنة ب 0.4 جرام.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos