تقييم العزل والتدفق الخلوي للتفاعلات المناعية العصبية في نموذج الفئران السكتة الدماغية المصغرة

يركز نطاق بحثنا على وظيفة الخلايا المناعية بعد السكتة الدماغية الإقفارية. نهدف إلى فهم قوانين الخلايا المناعية المقيمة والمتسللة في أمراض السكتة الدماغية. حاليا ، يستخدم قياس التدفق الخلوي على نطاق واسع لتقييم وظيفة الخلايا المناعية والتفاعلات في الالتهابات العصبية.

بالإضافة إلى ذلك ، تعمل تقنيات المناعة والخلية المفردة والتسلسل على تطوير البحث في التفاعلات المناعية العصبية. سيركز مختبرنا على توضيح مسار الخلايا النجمية في التفاعلات المناعية العصبية ، ومساهمات الأوعية الدموية في عمليات الالتهابات العصبية. للبدء ، خذ حقنة سعة 50 مل وقم بتوصيل إبرة قياس 26 في نهايتها.

املأ المحقنة بالكامل بمحلول ملحي. ضع الماوس المخدر في اتجاه ضعيف على لوح رغوي. قم بتمديد الأطراف الأمامية والأطراف الخلفية وقم بتثبيتها باستخدام إبر قياس 26.

باستخدام ملقط الإبهام المسنن ، أمسك جلد البطن وقم بعمل شق جانبي لفضح الكبد. قطع على جانبي الضلوع لكشف القلب. الآن أدخل إبرة قياس 26 في البطين الأيسر واقطع أوراكل الأيمن.

اضغط على مكبس المحقنة للسماح بتصريف الدم. استمر في التروية حتى يبدو الدم الذي يتم تصريف الدم من أوراكل صافيا. بعد قطع رأس الفأر واستخراج الدماغ ، انقله إلى مصفوفة دماغية فولاذية من الفأر وقسمها إلى شرائح قرنية متتالية بسمك ملليمترين.

أدخل 500 ميكرولتر من مزيج إنزيم الهضم في كل بئر من 12 بئر. باستخدام ملقط دقيق ، افصل أنسجة الاحتشاء بدقة وانقله إلى مزيج إنزيم الهضم. أخيرا ، قم بتقسيم الأنسجة بمقص العيون إلى أصغر قطع ممكنة واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

باستخدام ماصة AP 1000 ، قم بشفط المحلول برفق ووزعه 10 مرات لفصل الأنسجة إلى خلايا فردية. ثم مرر المحلول من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. اشطف بشكل متكرر كل من لوحة 12 بئر ومصفاة الخلية باستخدام HBSS المثلج الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم.

الآن قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية الذي تم جمعه عند 500 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص بعناية من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من PBS.

بعد تكرار عملية الطرد المركزي, أعد تعليق الحبيبات مرة أخرى في 150 ميكرولتر من PBS ونقل التعليق إلى 96 لوحة سفلية مستديرة جيدا. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 500 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، أمسك بقوة بلوحة البئر 96 واقلبها بسرعة للتخلص من المادة الطافية.

بعد ذلك ، قم بتخفيف تألق قابلية الخلية للبقاء بنسبة واحد إلى مائة في برنامج تلفزيوني وأعد تعليق الحبيبات في 150 ميكرولتر من محلول الصبغة المخفف. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع حماية الطبق من الضوء. بعد الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، تخلص من الطافية.

قم بتخفيف كوكتيل الأجسام المضادة لسطح الخلية في فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية أو الحد الأقصى للمخزن المؤقت وبدون غسل الخلايا ، أضف كوكتيل الأجسام المضادة إلى الآبار. احتضان لمدة 15 إلى 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية قبل الطرد المركزي لمدة خمس دقائق إضافية. بعد طرد اللوحة والتخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت الأقصى.

انقل التعليق إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مليلتر أو أنابيب اختبار البوليسترين ذات القاع المستدير بخمسة ملليلتر. صمم لوحة قياس التدفق الخلوي متعددة الألوان وفقا لتكوين الجهاز إما باستخدام الطرق اليدوية أو أداة تصميم اللوحة عبر الإنترنت. قم بتضمين صبغة قابلية للحياة في اللوحة لاستبعاد الخلايا والحطام غير القابل للحياة من البيانات.

اضبط إعدادات كاشف التشتت الأمامي وكاشف التشتت الجانبي للتأكد من عرض الخلايا ذات الأهمية بشكل صحيح ويمكن تغطيتها بشكل صحيح. اضبط معلمات FSC و SSC للتخلص من الحطام والضوضاء الخارجية. في مخطط نقطي يوضح منطقة FSC مقابل الارتفاع ، اميز الخلايا المضاعفة عن الخلايا المفردة.

استخدم الإشارة السلبية لصبغة الجدوى لعزل الخلايا القابلة للحياة. قارن التحكم في التألق الذاتي من الخلايا غير الملوثة مع عناصر التحكم الإيجابية للخلايا الملطخة للتأكد من أن الخلايا الملطخة قد تم تحجيمها بشكل صحيح لكل معلمة. اضبط التعويض عن طريق تحليل عينات الخلايا متعددة الألوان وفحص مخططين نقطيين ملونين.

اضبط إعدادات التعويض لأعلى أو لأسفل حتى تتماشى مجموعات الخلايا رأسيا أو أفقيا مع بعضها البعض. استخدم إشارات CD45 و CD11B للتمييز بين الخلايا الليمفاوية ، والدبقية الصغيرة ، والخلايا النخاعية ، والخلايا النجمية بناء على أنماط التعبير المحددة الخاصة بها. استخدم أنسجة المخ الزائفة كعنصر تحكم ذاتي التألق لتكون بمثابة مرجع لتحديد الخلايا الليمفاوية.

في حالة تحليل هدف معين ، استخدم عنصر تحكم FMO مع أنسجة المخ بعد السكتة الدماغية. اجمع بيانات التحكم واحفظها. وبالمثل ، اجمع بيانات العينة واحفظها.

حدد وفرز مجموعات الخلايا المستهدفة إما إلى أنابيب اختبار البوليسترين ذات القاع المستدير بخمسة ملليلتر أو أنابيب طرد مركزي مخروطية 15 ملليلتر. أضف 500 ميكرولتر من PBS واشطف أنبوب التجميع للحفاظ على بقاء الخلية والمساعدة في تكوين الحبيبات. تم قياس الخلايا الدبقية الصغيرة إيجابية CCR7 و CD11c الإيجابية في اليومين الثاني والسابع بعد السكتة الدماغية الإقفارية.

ارتفع تعبير CCR7 في الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل حاد في اليوم الثاني وظل مرتفعا في اليوم السابع مقارنة بالضوابط الزائفة. اتبعت الخلايا الدبقية الصغيرة الإيجابية CD11c اتجاها مشابها بلغت ذروتها في اليوم الثاني وظلت أعلى من الوهمية في اليوم السابع. أظهرت المخططات النقطية إشارات CCR7 و CD11c كثيفة في اليومين الثاني والسابع.

على النقيض من الإشارات المتفرقة في عناصر التحكم الزائفة. فصلت استراتيجية البوابات الخلايا النخاعية الدبقية الصغيرة والخلايا الليمفاوية باستخدام تعبير CD11B و CD45. حددت علامات إضافية الخلايا القابلة للحياة والخلايا النجمية ومجموعات فرعية للخلايا الليمفاوية.