استكشاف الأحداث الخلوية المتسلسلة للبلعمة الناجمة عن Godanti Bhasma في خلايا الثدييات

البلعمة ، حيث تبتلع الخلايا البلعمية وتتحلل الجسيمات الغريبة. إنه أمر بالغ الأهمية للدفاع المناعي. هناك حاجة إلى طرق محسنة سهلة الاستخدام لمراقبة وتقييم هذه العملية الخلوية المعقدة بكفاءة.

لا يزال التقاط أحداث التدهور في الوقت الفعلي وتجنب القطع الأثرية من تبييض الصور تحديات رئيسية في الدراسة الدقيقة للبلعمة والاتجار داخل الخلايا. على عكس الجسيمات الفلورية أو الاصطناعية ، يستخدم بروتوكولنا Godanti Bhasma ، وهو جسيم خال من الملصقات يتيح التصور المباشر لمراحل البلعمة دون تبييض الصور أو التحسين أو التحضير المعقد. توفر هذه النتائج نموذجا قابلا للتكرار لتشريح آليات البلعمة ، مما يوفر أدوات جديدة لدراسة ديناميكيات الحويصلات ، والخلل الوظيفي لمسببات الأمراض ، والتدخل العلاجي المحتمل للاضطرابات المناعية والليزوزومية.

نحن نهدف إلى استكشاف المنظمين الجزيئيين للبلعمة النضج ، والتحقيق في الخلل الوظيفي البلعمي في نماذج المرض ، وفحص الأدوية المحتملة التي تعدل ديناميكيات الحويصلات والاتجار داخل الخلايا. للبدء ، تزن بالضبط 100 ملليغرام من Godanti Bhasma أو مسحوق GB. المسحوق في 10 ملليلتر من DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.

قم بتدوير المعلق جيدا لخلط المحتويات واترك الخليط يقف لمدة دقيقة واحدة للسماح للجزيئات الكبيرة بالاستقرار في الأسفل. باستخدام ماصة ، انقل الخمسة ملليلتر العلوي من التعليق إلى أنبوب طرد مركزي معقم. قم بتسمية خمسة ملليلتر من تعليق GB المنقول كحل مخزون لمزيد من أعمال زراعة الخلايا.

قم بتدوير المعلق جيدا مرة أخرى لضمان تشتت الجسيمات بشكل متساو قبل إضافته إلى الخلايا. بذرة 3 10 إلى خلايا الطاقة الرابعة 3T3-L1 في طبق 35 ملم يحتوي على ملليلتر من DMEM. احتضن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تصل الخلايا إلى 70٪ من التقاء الزوجين.

ثم امزج 300 ميكرولتر من نظام تعليق مخزون GB جيدا في ملليلترين من وسط الاستزراع الطازج المسخن مسبقا. ضع طبق المزرعة الذي يحتوي على خلايا وتعليق GB على حاضنة المسرح لمجهر التصوير. حدد هدف 10x على المجهر.

قم بتشغيل إضاءة المجال الساطع باستخدام الزر الساطع. ثم قم بتشغيل برنامج DIGI ImagePlus وحدد الكاميرا المناسبة. انقر فوق الزر "التقاط" واختر خيار الفاصل الزمني.

اضبط الفاصل الزمني على خمس دقائق وابدأ التسجيل بالنقر فوق الزر "إنهاء". التقط صورا ميدانية ساطعة على فترات خمس دقائق بشكل مستمر لمدة 16 إلى 24 ساعة داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون في مرحلة المجهر. استخدم برنامج ImageJ لتجميع جميع الصور الملتقطة في فيديو بفاصل زمني.

يتيح ذلك تحديد مراحل البلعمة من استيعاب الجسيمات إلى تدهورها الكامل. بعد 24 ساعة من نمو الخلايا في 96 لوحة بئر ، امزج تعليق مخزون الجسيمات GB جيدا. أضف 30 ميكرولتر من المعلق إلى كل بئر.

استخدم الآبار التي لا تحتوي على جزيئات GB كعناصر تحكم سلبية. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة 24 ساعة للحث على تكوين الفجوة. لتحضير محلول أحمر محايد ، قم بإذابة اللون الأحمر المحايد لعمل محلول 0.5 ملليغرام لكل مليلتر في DMEM خالي من المصل.

قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. للتصوير ، قم بإزالة الوسائط من 96 لوحة بئر. بعد إضافة 60 ميكرولتر من صبغة المرشح إلى كل بئر ، احتضن اللوحة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة الصبغة الزائدة. ثم تابع التصوير المجهري. افحص الفجوات الملطخة تحت المجهر باستخدام هدف 20x لتقييم حجم الفجوات ومورفولوجيتها وعددها.

لتحضير محلول مخزون بافيلومايسين A1 ، قم بإذابة 100 ميكروغرام من المركب في 50 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد. ثم قم بتخفيفه ب 950 ميكرولتر من DMEM. بالنسبة لمحلول العمل ، قم بتخفيف ميكرولتر واحد من المخزون في 1.6 مل من DMEM للحصول على تركيز نهائي قدره 0.1 نانومولار.

امزج محلول العمل جيدا وأضف 100 ميكرولتر إلى الآبار التي تحتوي على خلايا في 96 لوحة بئر. ثم احتضان الخلايا في كل بئر ب 30 ميكرولتر من معلق الجسيمات GB لدراسة تثبيط تكوين الفجوة والبلعة. لمنع تحمض البلعمة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل بافيلومايسين A1 إلى الآبار التي تحتوي على فجوات مسبقة التشكيل عولجت مسبقا ب GB. احتضان جميع الآبار عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.

أضف 60 ميكرولتر من الصبغة الحمراء المحايدة إلى كل بئر. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية واغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة الصبغة الزائدة ، ثم تحليل تكوين الفجوة والتحمض تحت المجهر. عالج الخلايا المستنبتة ب 50 ميكرولتر من معلق GB واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ في ظل الظروف التجريبية القياسية.

بعد العلاج ، أضف محلول أكريدين برتقالي بتركيز ملليغرام واحد لكل مليلتر إلى الخلايا واحتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتلطيخ الفجوات والعضيات الحويصلية الحمضية. بعد ذلك ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS المعقم لإزالة أي صبغة غير مرتبطة وتقليل مضان الخلفية. أخيرا ، قم بتحليل الشرائح الملطخة على الفور باستخدام مجهر مضان مزود بهدف 20x ونطاق مرشح إثارة أزرق من 450 إلى 492 نانومتر.

تقييم التشكل الخلوي وامتصاص البرتقال الأكريدين لفهم ديناميكيات الفراغ. بعد 30 دقيقة من علاج GB ، لوحظت الجسيمات ملتصقة بسطح ثلاث خلايا 3T3-L1. ظهر كوب يشبه امتداد الغشاء حول الجسيم مما يشير إلى بدء ابتلاع الجسيمات.

بعد 12 ساعة من العلاج ، لوحظت فجوات كبيرة مرتبطة بالغشاء تحتوي على جزيئات GB داخل الخلايا. أظهر التصوير بفاصل زمني الاستيعاب التدريجي وتكوين الفجوة في خلية حية واحدة على مدار 4.75 ساعة. تدهورت جزيئات GB داخل الفجوات تدريجيا بمرور الوقت واستعادت الخلية مورفولوجيا طبيعية كما يتضح من دوران الفراغ.

أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن جزيئات Godanti Bhasma الداخلية قد تحللت تماما في غضون 24 ساعة مع عدم وجود جزيئات متبقية في وسط الاستزراع. كشف التلوين الأحمر المحايد عن تحمض فجوة أعلى بشكل ملحوظ في الخلايا المعالجة ب GB لجميع خطوط الخلايا الثلاثة مقارنة بالضوابط التي أظهرت تلطيخا ليزوزوميا ضعيفا فقط. أظهر تلطيخ أكريدين البرتقالي التألق الأحمر البرتقالي في فجوات خلايا GB 3T3-L1 مما يشير إلى التحمض ، بينما أظهرت الخلايا غير المعالجة التألق الأخضر فقط.

أدى العلاج المشترك مع بافيلومايسين إلى تثبيط تكوين الفجوة في كل من خلايا 3T3-L1 و HeLa كما يتضح من عدم وجود فجوات مقارنة بعناصر التحكم الخاصة بكل منها. بعد العلاج بالبافيلوميسين ، تم منع امتصاص اللون الأحمر المحايد بشكل فعال مما أدى إلى تعطيل تحمض الفجوة ونضجها في الخلايا.