خط أنابيب للتلفيق لتوليد وحدات التصنيف التشغيلية الجزيئية (MOTUs) بين الخنافس النهرية والمائية

سعيا لتسريع اكتشاف الأنواع في المناطق الاستوائية المتنوعة MEGA ، يهدف هذا البروتوكول إلى توليد فرضية تجميع الأنواع في الخنافس المائية والنهرية باستخدام مزيج من التحليل المستند إلى الكمبيوتر.

أدى خط أنابيب الخليط هذا ، الذي استخدم تسلسل COI DNA ، إلى أدلة أكبر على تحديد الأنواع للخنفساء المشفوفة من جنس Anisostena ، والذي تم تشييده سابقا فقط باستخدام البيانات المورفولوجية.

يسعى هذا البروتوكول إلى معالجة العائق التصنيفي الذي تكتشفه الأنواع من خلال التصنيف القائم على التشكل ، والذي يعتبر المعيار الذهبي في علم الحشرات النظامي ، غالبا ما يستغرق وقتا طويلا ومربكا للخنافس المائية غير المدروسة ، ولكنها متنوعة وغير واضحة للغاية.

[إيمانويل] يولد خط الأنابيب هذا فرضيات ملحقات جزيئية تسمى MOTUs ، بغض النظر عما إذا كان التسلسل يتوافق مع الأنواع المعروفة لكل تسلسل مشار إليه ، أو ما إذا كانت الأنواع غير مكتشفة أو غير موصوفة.

مع هذا ، بدلا من تشريح ومقارنة المئات من الهياكل التناسلية للخنفساء دفعة واحدة ، يوفر خط الأنابيب تجميعا أوليا يمكن من خلاله فحص العينات من أجل المطابقة.

[راوي] للبدء ، قم بتشغيل MEGA X وقم بتحميل تسلسل الحمض النووي للمحاذاة. افتح واجهة المحاذاة عن طريق تحديد خط ، ثم النقر فوق تحرير أو بناء محاذاة ، واختيار إنشاء محاذاة جديدة. انقر فوق موافق لتأكيد التحديد وحدد الحمض النووي كنوع البيانات. مرر مؤشر الماوس فوق علامة تبويب التحرير. انقر فوق إدراج تسلسل من الملف. انتقل إلى الدليل المناسب وحدد ملفات التسلسل المراد تحميلها في MEGA. الآن ، انقر فوق المحاذاة ، ثم حدد محاذاة بواسطة ClustalW لمحاذاة التسلسلات باستخدام الإعدادات الافتراضية وانقر فوق "موافق" للمتابعة. للتحرير اليدوي للتسلسلات ، احذف أي إدخالات بالنقر فوق القواعد أو المواضع المدرجة والضغط على مفتاح الحذف على لوحة المفاتيح. بعد ذلك ، قم بتصحيح عمليات الحذف بالنقر فوق الشرطة التي تمثل قاعدة مفقودة ، وإزالتها ، وكتابة القاعدة المقصودة. بعد ذلك ، ابحث عن الموضع الأقدم حيث تحتوي جميع التسلسلات على حرف. انقر فوق المربع الفارغ في رأس الصف مباشرة على يسار هذا الموضع واسحب لتحديد جميع مواضع البداية الزائدة. اضغط على حذف لقصها. بعد ذلك ، ابحث عن آخر موضع محاذاة وانقر على المربع الموجود على يمين هذه النقطة. اضغط على حذف مرة أخرى لقص النهاية. الآن ، حدد جميع التسلسلات وانقر فوق علامة التبويب تسلسلات البروتين المترجمة. عند المطالبة، تحقق من الشفرة الوراثية على أنها ميتوكوندريا اللافقاريات. إذا كان الرمز الجيني مختلفا ، فانقر فوق لا وستظهر قائمة ، مما يسمح للمرء بتحديد مربع الشفرة الوراثية للميتوكوندريا اللافقارية. إذا ظهرت أكواد التوقف المميزة بعلامة النجمة في المحاذاة عبر عمود كامل ، فانقر فوق تسلسل الحمض النووي واحذف الموضع الأول لجميع التسلسلات. مرة أخرى ، انقر فوق تسلسل الحمض النووي ، ثم احفظ المحاذاة بتنسيق .mos أو .mosx. لبدء التعيين باستخدام الوحدة النمطية TaxonDNA ، افتح برنامج TaxonDNA. انقر فوق استيراد ، ثم حدد FASTA وقم بتحميل ملف المحاذاة بتنسيق FASTA. الآن ، انقر فوق الوحدات النمطية ، ثم حدد نظام المجموعة. قم بتعيين قيمة الحد إلى 3٪ وحدد المربع المسمى إنشاء معلومات فردية في كل مجموعة. انقر فوق إنشاء مجموعات الآن لبدء التجميع وحفظ النتائج عن طريق التقاط لقطة شاشة. لترسيم الحدود باستخدام طريقة Kimura 2-Parameter ، افتح MEGA وانقر فوق الملف ، ثم حدد فتح ملف أو جلسة. انقر على المسافة. حدد حساب المسافات الزوجية وقم بتأكيد ملف .meg لتعيين الحدود. مرر مؤشر الماوس فوق المربع بجوار الطراز أو الطريقة وانقر فوق السهم لتوسيع القائمة المنسدلة. حدد نموذج Kimura 2-Parameter وانقر فوق "موافق" لتشغيل البرنامج. افتح نافذة إخراج البيانات لعرض النتائج. انقر فوق ملف ، ثم حدد تصدير وطباعة المسافات لحفظ النتيجة. افتح أنواع التجميع عن طريق التقسيم التلقائي أو خادم الويب في أسرع وقت ممكن. انقر فوق المربع البرتقالي المسمى ، واختر ملفا وقم بتحميل ملف .fasta. قم بالتمرير لأسفل وانقر فوق انتقال. لتنزيل نتيجة التجميع، انقر فوق قائمة الصف الذي يحتوي على أدنى درجة في أسرع وقت ممكن وأعلى رتبة قيمة P. بعد ذلك ، لبدء تقدير الشجرة ، افتح MEGA وانقر فوق البيانات. ثم حدد فتح ملف أو جلسة لتحميل ملف .meg. انقر فوق النماذج ، ثم حدد العثور على أفضل نماذج الحمض النووي والبروتين أو مل لتحديد أفضل نموذج استبدال مناسب. انقر فوق موافق في قائمة تفضيلات التحليل. الآن ، لإنشاء الشجرة ، انقر فوق نسالة ، ثم حدد إنشاء واختبار شجرة الاحتمالية القصوى. استخدم نموذج الاستبدال الأنسب بالنقر فوق المربع بجانب النموذج أو الطريقة وتحديد النموذج المناسب من القائمة المنسدلة. ضمن اختبار السلالة ، انقر فوق المربع بجانب اختبار السلالة ، ثم اختر طريقة التمهيد من القائمة المنسدلة. انقر فوق المربع بجانب عدد النسخ المتماثلة للتمهيد. اكتب 1,000 وانقر فوق موافق لتشغيل التحليل. بمجرد فتح النافذة التي تحتوي على الشجرة الناتجة ، احفظ الجلسة كملف .mts أو .mtsx. احفظ الإخراج أيضا كملف .newick وقم بتصدير الشجرة كصورة .png. للحصول على التعيين المستند إلى PTP، قم بزيارة خادم ويب PTP. انقر فوق اختيار ملف وقم بتحميل الشجرة بتنسيق Newick. تحت شجرتي هو اختيار الجذور. في المربع الموجود أسفل أسماء الأصناف الخارجية، أدخل المجموعة الخارجية عن طريق كتابة اسم تلميح التصنيف. بعد ذلك ، ضمن حل الاحتمالية القصوى ، انقر فوق تنزيل نتائج تحديد الحدود لحفظ إخراج PTP ML. وبالمثل ، ضمن أعلى حل مدعوم من Bayesian ، انقر فوق تنزيل نتائج تحديد الحدود لحفظ إخراج PTP BI. للقيد المستند إلى MPTP بواسطة MPTP، تفضل بزيارة خادم ويب MPTP. قم بتحميل ملف Newick عن طريق سحبه إلى المربع الرمادي أو بالنقر فوق المربع. بمجرد تحميل البيانات ، انقر فوق متابعة إلى تحديد المجموعة الخارجية. في صفحة مواصفات المجموعة الخارجية، حدد المجموعة الخارجية بالنقر فوق خانة الاختيار الموجودة بجوار تسميات الأصناف لعينات المجموعة الخارجية. ثم انقر فوق اختيار النموذج ، وحدد MPTP ، وانقر فوق خيارات التصور. في صفحة خيارات المرئيات، اقبل الإعدادات الافتراضية. انقر فوق إرسال. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الملفات الموجودة أسفل الملفات القابلة للتنزيل واختر حفظ لحفظ النتائج. الآن لإنشاء الوحدات التصنيفية التشغيلية الجزيئية أو MOTU ، افتح الشجرة باستخدام برنامج تحرير الصور أو PowerPoint. قم بإنشاء شريط لتمثيل نتائج كل نهج لتحديد الأنواع الجزيئية. إذا أسفرت جميع الأساليب عن نتائج متطابقة لمجموعة جزيئية معينة ، فقم بتعيين المجموعة على أنها MOTU بالإجماع. يقدم هذا الشكل الحد الأقصى لاحتمال شجرة الجينات ونتائج التجميع الجزيئي لخنافس البورانوس بناء على تسلسلات COI 3-prime وست طرق لترسيم الحدود. حددت جميع الطرق باستمرار أربعة MOTUS و Byrrhinus negrosensis و Byrrhinus villarini Byrrhinus A و Byrrhinus B مع تجميع متطابق عبر الطرق. تم فصل Byrrhinus negrosensis و Byrrhinus villarini بوضوح ، على الرغم من نشأتهما من نفس المواقع. تم تجميع التسلسلات من أربع مقاطعات في Byrrhinus A ، مما لا يظهر أي هيكلة جغرافية قوية. يوضح هذا الشكل تجميع خنافس Anisostena في أربعة MOTUS ، بما في ذلك Anisostena angatbuhay و Anisostena auxilium و Anisostena A و Anisostena B مع الاتفاق الكامل عبر الطرق. تداخل Anisostena auxilium جغرافيا مع Anisostena A و Anisostena B ، مما يشير إلى أن الجغرافيا وحدها لم تفسر الاختلاف الجزيئي.