في الجسم الحي تصوير النشاط العصبي في ذبابة الفاكهة البالغة غير المخدرة

نحن نحاول فهم الأساس الجزيئي والخلوي والدائري لنسيان الذاكرة الطبيعية ، بهدف الكشف عن كيفية محو الدماغ أو قمعه بنشاط للذكريات للحفاظ على المرونة المعرفية. أظهرت الأبحاث الحديثة أن النسيان ليس مجرد اضمحلال سلبي للذكريات ، بل هو عملية بيولوجية نشطة عالية التنظيم تتطلب أنماطا محددة من النشاط العصبي.

يتمثل التحدي الرئيسي في ربط التلاعب بدوائر معينة بعمليات الذاكرة الديناميكية مع دمج البيانات الشبكية والوراثية والسلوكية بطريقة صارمة وقابلة للتفسير. لقد ساعدنا في إثبات أن النسيان هو عملية نشطة منظمة بيولوجيا. حدد عملنا الخلايا العصبية الدوبامين المحددة والمسارات الجزيئية اللازمة للنسيان الطبيعي في ذبابة الفاكهة الدماغ. يتيح بروتوكولنا التصوير الوظيفي للذباب بدون تخدير ، مما يمنع التأثيرات غير المحددة غير المرغوب فيها بواسطة التخدير. نستخدم هذا النهج للتحقيق في الارتباطات العصبية الكامنة وراء تكوين الذاكرة ونسيان الذاكرة النشطة.

[الراوي] للبدء ، استخدم أدوات Dremel وشفرة المنشار الماسية لقطع أنبوب معدني تحت الجلد عيار 22 بطول 10 سم تقريبا. باستخدام عجلة القطع Dremel 420 ، قم بتلميع طرفي الأنبوب لإنشاء فتحة ناعمة ونظيفة يمكن أن تستوعب خرطوم الذبابة. لف الأنبوب المقطوع حول أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر لتشكيل الشكل المنحني المطلوب. ثم قم بقطع قطعة بطول 7 سم من أنابيب معدنية تحت الجلد قياس 12. استخدم الآن شفرة حلاقة لتقليم نهاية طرف الماصة سعة 2 ميكرولتر لتناسب الأنابيب المعدنية قياس 22. ضع الأنبوب قياس 12 في الطرف الآخر من طرف الماصة. بعد ذلك ، اخلطي كمية صغيرة من راتنجات الايبوكسي والمقسى معا. ضع الإيبوكسي على التقاطعات حيث يلتقي الأنبوب المعدني الصغير بطرف الماصة وحيث يتصل الأنبوب الأكبر بالطرف الآخر. اسمح للإيبوكسي بالشفاء الكامل طوال الليل قبل توصيل التجميع بحامل مناور دقيق وضبط الزاوية حسب الضرورة. لبناء ماصة توصيل الصدمات والرائحة، قم بقطع 1 ملليلتر من ماصة زجاجية 1 × 100 عند علامة 3 ملليلتر باستخدام أداة Dremel الماسية. ثم قم بقص لوح أكريليك صغير مستطيل الشكل بقياس 24.5 ملم × 8 ملم بسمك 1/8 بوصة. قم بقص شبكة صدمات نحاسية لتناسب قطعة الأكريليك المستطيلة. لحام سلكين كهربائيين على طرفي نقيض من الشبكة النحاسية. الآن ضع الشبكة النحاسية على قطعة الأكريليك وثنيها قليلا لاستيعاب بطن الذبابة وساقيها. استخدم شريطا كهربائيا لربط الشبكة النحاسية بقطعة الأكريليك. ثم استخدم مسدس الغراء الساخن لتوصيل الماصة الزجاجية بشبكة الصدمات ، مما يضمن أنها مستقيمة ومركزية. لبناء غرفة التسجيل ، خذ شريحة مجهر زجاجي كقاعدة للغرفة. امزج الراتنج وغراء الايبوكسي معا. باستخدام غراء الايبوكسي ، قم بإرفاق مغناطيس النيوديميوم على جميع الزوايا الأربع لغرفة الأكريليك السوداء. ضع مغناطيسا إضافيا فوق كل مغناطيس لاصق. ثم قم بلصق المغناطيس الموضوع حديثا على شريحة زجاجية باستخدام الايبوكسي. امسك التجميع في مكانه باستخدام مشابك الورق أثناء المعالجة. قم بإزالة طرف الماصة سعة 200 ميكرولتر من الشفاطة. أدخل الشفاط في قارورة تحتوي على ذبابة الفاكهة واستنشق ذبابة واحدة في طرف الماصة سعة 1,000 ميكرولتر. أعد تركيب طرف الماصة سعة 200 ميكرولتر مرة أخرى على الشفاطة. ثم قم بنفخ الشفاط ونقره برفق حتى يتم تثبيت الذبابة رأسا على عقب في الجزء العلوي من طرف الماصة سعة 200 ميكرولتر. بعد ذلك ، ضع غرفة التشريح على حامل المناور. قم بتوصيل المكنسة الكهربائية بأنبوب تثبيت الذبابة واضبط معدل التدفق إلى حوالي 500 مل في الدقيقة. الآن انقل الأنبوب المعدني المفرغ إلى مركز مجال رؤية المجهر. قم بشفط خرطوم الذباب برفق في حامل الفراغ. اضبط المناور لمحاذاة رأس الذبابة مع فتحة الغرفة. قم بتشغيل مصدر طاقة التيار المباشر. باستخدام سلك مقاومة البلاتين ، ضع حمض الميريستيك المذاب للصق العينين والصدر على الغرفة. بمجرد تأمينه، افصل أنبوب التفريغ. قم بإزالة غرفة التسجيل من وصلة التفريغ باستخدام المناور واقلب الغرفة رأسا على عقب. ثم قم بلصق خرطوم من الأسفل باستخدام مقاومة البلاتين. عندما يتم لصق كل شيء ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة الحالي المباشر. ثم اقلب الغرفة في وضع مستقيم. اربط الغرفة بقاعدة الشريحة الزجاجية. اقطع قطعة صغيرة من الشريط بالمقص وضعها أمام وخلف رأس الذبابة. قم بتدوير الغرفة بحيث يواجه رأس الذبابة المجرب بزاوية 90 درجة. باستخدام إبرة تشريح ، قم بعمل شقوق رأسية على جانبي العينين. قم بتدوير الغرفة أفقيا. ثم قم بعمل قطع أفقي عبر بشرة. أضف الآن 100 ميكرولتر من المحلول الملحي إلى الجزء العلوي من رأس الذبابة. باستخدام ملقط حاد ، قم بإزالة نافذة البشرة ، ثم قم بإزالة أي دهون متبقية أو قصبة هوائية بالملقط. ضع ذبابة معدة على مرحلة المجهر في مجهر متحد البؤر مزود بالليزر وهدف الغمر في الماء. باستخدام مناور دقيق ، اضبط موضع شبكة الصدمات وماصة الرائحة بحيث يتم وضع الذبابة بشكل صحيح على شبكة الصدمات. استخدم مقبض ضبط الدورة التدريبية z للمسح الضوئي من خلال المحور z للدماغ وتحديد منطقة الدماغ التي تهمك. اضبط حجم الإطار على 512 × 512 بكسل. ابدأ التسجيل من الخلايا العصبية ذات الأهمية باستخدام نظام توصيل رائحة مخصص أو متاح تجاريا. اضبط مدة التسجيل على دقيقتين. ابدأ بروتوكول التدريب باستخدام نظام توصيل الرائحة بعد 5 دقائق من جمع استجابات ما قبل التدريب. ثم سجل استجابات ما بعد التدريب بعد حوالي 5-15 دقيقة من التدريب. تم التعبير عن مؤشر الكالسيوم GCaMP6f والبروتين الفلوري الأحمر tdTomato بشكل انتقائي في الخلايا العصبية الناتجة لجسم الفطر مع التشعبات البارزة في فصوص جاما وألفا اندفاعة في جسم الفطر ، وتم تصور الخلايا العصبية باستخدام خط تشغيل MB077C split-GAL4. انخفضت استجابات الكالسيوم في الخلايا العصبية الناتجة لجسم الفطر إلى 3-أوكتانول بشكل ملحوظ بعد 5 دقائق من التكييف العكسي دون تخدير وظلت مكبوتة في 15 دقيقة. في المقابل ، تم تعزيز استجابات الكالسيوم ل 4-methylcyclohexanol بشكل كبير بعد 5 دقائق من التدريب وظلت مرتفعة في 15 دقيقة. أظهرت الصور الملونة الزائفة تغيرات مضان مميزة قبل التدريب وبعده. في الذباب المخدر ، انخفضت استجابات الكالسيوم بعد التدريب ل CS + جزئيا فقط ولم تختلف الاستجابات ل CS- اختلافا كبيرا عن خط الأساس. أكد التحليل الكمي أن استجابة CS + كانت مكتئبة بشكل كبير بعد التدريب في الذباب المخدر ، لكن استجابات CS ظلت دون تغيير إحصائيا. كانت اللدونة أعلى بشكل ملحوظ في الذباب غير المخدر مقارنة بالذباب المخدر.