استخدام طريقة نقل القطرات لتحضير حويصلات أحادية الصفائح العملاقة بشكل موثوق

نحن نهدف إلى الروبوتات الدقيقة الشبيهة بالخلايا التي تتنقل عبر أنسجة الجسم لإدارة العلاجات محليا. إنها تعتمد على حويصلات عملاقة أحادية الصفائح وغشاء فوسفوليبيديك وتحتوي على جزيئات نشطة. يقدم هذا البروتوكول دليلا للمبتدئين الذين يرغبون في اعتماد طريقة نقل القطرات وتكييفها في البيولوجيا التركيبية وفي مجالات أخرى ، على سبيل المثال ، في الروبوتات الدقيقة.

بالمقارنة مع تقنيات تحضير GUV الأخرى ، يوفر هذا البروتوكول كفاءة تغليف عالية وتنفيذا مباشرا ، مما يجعله في متناول أي مجموعة بحثية بمعدات مختبرية أساسية. سنقوم بتقييم التنقل بين الروبوتات الدقيقة القائمة على GUV في إعدادات شبيهة بالأنسجة وتنفيذ استراتيجيات الاستشعار لتمكين الحركة المستقلة نحو الخلايا المريضة. للبدء ، حرك حجرة القفازات إما داخل أو بجانب غطاء كيميائي.

افتح حجرة القفازات وضع جهاز بلورة مملوء بجزيئات السيليكا في الجزء السفلي من الغرفة. قم بتغطية جهاز التبلور بسطح دعم أبيض ، ثم ضعه بمناشف ورقية. أدخل جميع المواد المطلوبة في حجرة القفازات ، وضع القارورة الزجاجية التي تحتوي على محلول الكلوروفورم على حامل حلقة من الفلين أو دورق سعة 150 مل موضوعة بالقرب من جانب المشغل قدر الإمكان.

الآن ، أغلق حجرة القفازات ، وتأكد من محاذاة النصفين بإحكام ولا يمكن أن ينزلقا. استخدم البراغي البلاستيكية المرفقة لإغلاق الغرفة تماما. أغلق صمام المخرج واغمس الأنبوب رقم خمسة في دورق سعة 500 مل نصف مملوء بالماء.

بعد ذلك ، قم بتوصيل الطرف المنظم بالصمام للأنبوب رقم اثنين بخط التفريغ. ثم قم بتوصيل الطرف الآخر بخط النيتروجين باستخدام الأنبوب رقم ثلاثة. افتح الصمام وقم بتشغيل خط التفريغ حتى تنتفخ القفازات وتصبح صلبة جدا بحيث لا يمكن ثنيها.

ثم أغلق كل من خط التفريغ والصمام. بعد ذلك ، افتح خط النيتروجين حتى تنكمش القفازات وتمتد من غرفة القفازات. بعد ارتداء القفازات ، استخدم حقنة هاميلتون لنقل الحجم المحدد من DOPC في محلول الكلوروفورم إلى قارورة زجاجية داكنة.

أغلق القارورة بالغطاء الذي يحتوي على الإبر. الآن ، قم بتوصيل الأنبوب رقم ستة بالأنبوب رقم ثمانية والأنبوب رقم سبعة بالأنبوب رقم تسعة باستخدام التقاطعات ثنائية الاتجاه. قم بإزالة القفازات من حجرة القفازات وافتح صمام المخرج.

بعد ذلك ، افتح خط النيتروجين ببطء وراقب تدفق الغاز بحثا عن الفقاعات في الدورق قم بزيادة تدفق النيتروجين تدريجيا حتى يتم الوصول إلى معدل فقاعات ثابت ولكن يمكن ملاحظته. بعد ثلاث دقائق من التدفق ، أغلق خط النيتروجين.

بمجرد خروج الفقاعة النهائية من الدورق ، أغلق صمام المخرج. ضع القفازات مرة أخرى وافصل الأنابيب ثمانية وتسعة من التقاطعات ذات الاتجاهين. بعد ذلك ، افتح القارورة وانقل الغطاء مرة أخرى إلى أنبوب 50 مل.

ثم افتح زجاجة الزيت وانقل الكمية المطلوبة من الزيت إلى القارورة المظلمة. أغلق القارورة بالغطاء مرة أخرى ، وقم بإزالة القفازات ، وافتح حجرة القفازات. دوامة قارورة تعليق الدهون محكمة الغلق بقوة لمدة 30 ثانية على الأقل.

ثم احتضنه على حرارة 80 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة. بعد دوامة القارورة مرة أخرى ، احتضنها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. باستخدام المقص ، اقطع الغطاء من أنبوب سعة خمسة ملليلتر.

احفر ثقبا يبلغ طوله ثمانية ملليمترات تقريبا في منتصف الغطاء ليناسب طرف الماصة P1000. إذا كانت الفتحة واسعة جدا بحيث لا تناسب الطرف ، فتخلص من الغطاء وأعد تشغيله بغطاء جديد. مع شريط من ورق الصنفرة بطول سنتيمترين في خمسة سنتيمترات ، ناعم في حواف الحفرة المحفورة.

ضع الغطاء مرة أخرى على الأنبوب سعة خمسة ملليلتر وجهاز طرد مركزي عند 3،000 جم لمدة خمس دقائق للتخلص من أي جزيئات بلاستيكية متبقية. ثم قم بإزالة الغطاء وتخلص من الأنبوب. الآن ، قم بقص الغطاء من أنبوب جديد سعة خمسة ملليلتر واستبدله بالغطاء المثقوب المحضر.

أدخل طرفا من طراز P1000 من خلال الفتحة مع قفل حلقة O بين الطرف والغطاء لمنع المزيد من الحركة لأسفل. املأ الأنبوب ب 5.5 مل من المحلول الخارجي من خلال الحافة. دوامة قارورة تعليق الدهون التي تم إعدادها مسبقا لمدة 30 ثانية على الأقل.

ثم احتضنه في حمام مائي 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. اترك محاليل المياه المحضرة مسبقا تتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على الأقل. الآن ، ماصة 300 ميكرولتر من المحلول الخارجي في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر أو أنبوب خمسة ملليلتر معدل مسبقا.

ضع طبقة ببطء 100 ميكرولتر من معلق الدهون فوق محلول الزيت ، مما يضمن تكوين مرحلتين متميزتين ومستمرتين. دع الواجهة تقف دون إزعاج لمدة 10 دقائق لتتوازن. في أنبوب سعة ملليلتر، ماصة 250 ميكرولتر من تعليق الدهون، متبوعة ب 6.25 ميكرولتر من المحلول الداخلي لتحضير مستحلب ماء في زيت بنسبة 2.5٪.

امزج المرحلتين حتى يبدو المستحلب متجانسا ومستقرا. انقل 200 ميكرولتر من المستحلب المحضر إلى واجهة تعليق الدهون بمحلول الزيت التي تم تشكيلها سابقا. إذا كنت تستخدم أنبوبا سعة 1.5 مليلتر ، فما عليك سوى إغلاق الأنبوب.

في حالة استخدام أنبوب معدل سعة خمسة ملليلتر ، ضع غطاءا مطاطيا على طرف الماصة وانقل الأنبوب بأكمله برفق إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. قم بالطرد المركزي للأنابيب في درجة حرارة الغرفة بالسرعة المناسبة. بعد الطرد المركزي, تحقق من وجود حبيبات غير شفافة في الأسفل وأن مرحلة الزيت واضحة في الأعلى.

لإزالة الزيت من الأنبوب سعة خمسة ملليلتر الذي يحتوي على GUVs، استرجع طرف الماصة من الأنبوب مع التأكد من بقاء الغطاء المطاطي في مكانه. تخلص من الطرف واحتفظ بالغطاء المطاطي والحلقة O وغطاء التثبيت لاستخدامه في المستقبل. بدلا من ذلك ، إذا كنت تستخدم أنبوبا سعة 1.5 ملليلتر ، فاستخدم ماصة دقيقة P1000 لإزالة محلول الزيت ، تاركا وراءك حوالي 50 ميكرولتر وتأكد من عدم إزعاج الحبيبات.

قم بتغيير طرف الماصة ، ثم أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر المتبقية من المحلول. أخيرا ، انقل المواد المعلقة إلى أنبوب نظيف سعة ملليلترين. أنتجت المحاليل الدهنية المحضرة في ظل ظروف الرطوبة العالية حويصلات عملاقة أحادية الصفائح ذات عوائد أقل بكثير وانتشار أكبر للركام المضطرب مقارنة بتلك المحضرة في غرفة يتم التحكم فيها بالرطوبة ، على الرغم من أن بعض الركام كانت لا تزال موجودة في الأخير.

عند 3 ، 300 جم لمدة 20 دقيقة ، كان محصول وجودة الحويصلات المحملة بالسكروز هو الأمثل ، في حين أن سرعات الطرد المركزي المنخفضة والأعلى تسمح بنتائج غير مواتية ، مثل انخفاض المحصول أو تكوين الركيوم. نتج عن الزيت المعدني حويصلات ذات متوسط توزيع قطر أكبر ، بينما ولد زيت السيليكون AR 20 عددا إجماليا للحويصلات أعلى بكثير.