تحليل ثلاثي الأبعاد متزامن لتلف القلب والاستجابة المناعية في احتشاء عضلة القلب الحاد المتكرر باستخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية

نحن ننظر إلى تفاعل الخلايا المناعية والأنسجة التالفة بعد احتشاء عضلة القلب. نهدف إلى فهم الاستجابة المناعية وتحسين وظائف القلب. تم اقتراح أنه بعد احتشاء عضلة القلب ، يجب تعديل جميع الكيانات الخلوية الرئيسية الثلاثة وخلايا عضلة القلب والخلايا والخلايا المناعية من خلال استراتيجيات متعددة الأهداف في نفس الوقت.

بالإضافة إلى التحليل المتزامن لتلف القلب والاستجابة ، يمكننا إظهار التوطين ثلاثي الأبعاد لهذه المناطق المتضررة ، والذي لم يكن معروفا من قبل. يوفر التحليل ثلاثي الأبعاد ، خاصة عند تعدد إرسال الأهداف المختلفة ، طريقة أكثر قوة لتقييم التركيب الخلوي بعد احتشاء عضلة القلب. للبدء ، ضع الفأر الرحيم تحت مجهر ستيريو.

باستخدام مقص ناعم ، افتح تجويف الصدر وشق الوريد الأجوف العلوي المكشوف بالقرب من خروج الوعاء من القفص الصدري إلى الرقبة. باستخدام إبرة قياس 27 متصلة بمضخة أسطوانية ، قم بتشغيل القلب في الموقع عبر أوراكل الأذينين الأيمن والأيسر مع احتواء PBS على الهيبارين. تأكد من إزالة الدم القلبي بشكل كاف من خلال ملاحظة تلاشي الرسم الوعائي السطحي للقلب وتبييض الرئة والكبد.

استئصال القلب مع ما لا يقل عن خمسة ملليمترات من الشريان الأورطي المتبقي وأنسجة الرئة المحيطة به باستخدام الملقط والمقص ، ونقله إلى طبق بتري يبلغ طوله ستة سنتيمترات مملوء مسبقا ب PBS المثلج والشاش. الآن ، قم بقطع أنسجة الرئة والدهون والأوعية الدموية المتبقية حتى يبقى القلب الذي يحتوي على حوالي خمسة ملليمترات من الشريان الأورطي فقط. انقل القلب إلى طبق معد لقنية الأبهر واسحب الشريان الأورطي المتبقي فوق قنية فولاذية حادة قياس 20.

قم بتثبيته على شق القنية بخياطة جميلة 5-0. قم بإخراج الشريان الهابط الأمامي الأيسر بشكل دائم بخيطة 6-0 في الموقع المستخدم لتحريض احتشاء عضلة القلب الحاد المتكرر. حقن 400 ميكرولتر من PBS يحتوي على 20 ميكروغراما من الجسم المضاد NT CD31 للفأر ، المسمى ب LexaFluor 546 إلى الوراء عبر القنية المدخلة.

اسحب القنية بعناية من الشريان الأورطي وانقل القلب إلى أنبوب تفاعل بولي بروبيلين سعة 15 مل يحتوي على 10 ملليلتر من 4٪ بارافورمالديهايد. احتضن الأنبوب طوال الليل عند أربع درجات مئوية في الظلام دون تحريض. اغسل القلب المثبت بثلاثة تغييرات بحجم خمسة ملليلتر من PBS لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، باستخدام دوران شبه علوي للتحريض داخل أنابيب تفاعل البولي بروبلين سعة خمسة ملليلتر.

قم بتجفيف القلب المثبت بخمسة ملليلتر من 50٪ من الإيثانول في ماء منزوع الأيونات لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، مع التحريك مع دوران شبه علوي في أنابيب تفاعل سعة خمسة ملليلتر. لتبييض القلب المجفف ، انقله إلى أنبوب تفاعل 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من 100٪ من الإيثانول مع 5٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 5٪ بيروكسيد الهيدروجين ، واحتضانه عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة أربع ساعات دون تحريض. اغسل القلب المبيض بخمسة ملليلتر من الإيثانول بنسبة 100٪ ثلاث مرات لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، باستخدام الدوران القريب من النفقات العامة للتحريض في أنابيب تفاعل سعة خمسة ملليلتر.

انقل القلب إلى أنبوب تفاعل خمسة ملليلتر يحتوي على أربعة ملليلتر من إيثيل سينامات واحتضنه دون إثارة لمدة ثلاثة أيام في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قم بقص كتل الجل واللثة التي تم تطهيرها إلى الحجم الذي يثبت القلب الذي تم تطهيره في حامل عينة المجهر. استخدم عدسة موضوعية ذات فتحة عدسة رقمية 0.1 بمسافة عمل تبلغ 17.6 ملم للحصول على الصور.

ثم اكتشف إشارات التألق باستخدام إعدادات مرشح الإثارة والانبعاث المناسبة. للتصوير المجهري للصفائح الخفيفة ، اختر فتحة رقمية للورقة تبلغ 0.079 ، مما ينتج عنه سمك ورقة خفيفة تبلغ خمسة ميكرومترات. اضبط المسافة بين طائرتين Z فرديتين على 10 ميكرومتر.

استخدم عرض ورقة 100٪ لتحقيق إضاءة متجانسة للعينة. يتم توضيح شرائح القلب التمثيلية التي تحدد المنطقة المعرضة للخطر ، وإصابة البطانة والعدلات المتسللة باستخدام تلطيخ الأجسام المضادة متعددة القنوات والتألق الذاتي في هذا الشكل. تم تحديد المنطقة المعرضة للخطر من خلال غياب تلطيخ CD31 بعد الحقن الرجعي ، وإصابة البطانة عن طريق سلبية CD31 في الوريد وتسلل العدلات عن طريق البقع الإيجابية ل Ly6G ، معظمها بالقرب من مناطق الإصابة.

أظهرت العروض ثلاثية الأبعاد تداخلا بين AAR والإصابة البطانية ومجموعات العدلات ، مما يشير إلى توطين مناعي خاص بالمنطقة. أظهر القياس الكمي 90.2٪ من العدلات في AAR مقابل 9.8٪ في المناطق النائية ، مما يشير إلى التهاب موضعي. داخل AAR ، كانت 79.3٪ من العدلات خارج أحجام إصابات البطانة و 20.7٪ في الداخل ، مما يشير إلى التجمع المحيطي حول الضرر.