عزل وثقافة وتوصيف الخلايا الليفية المرتبطة بسرطان البروستاتا

نحن نهدف إلى فهم الآلية التي تساهم بها الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان في تطور الورم في سرطان البروستاتا بهدف تحييد هذا الحديث المتبادل كاستراتيجية علاجية. يمكن تقييم المجموعات المتميزة من CAFs ذات الخصائص المختلفة في العضيات ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها باستخدام الخلايا السرطانية واللحمية عند التلاعب المختلفة. يسمح بروتوكولنا بإنشاء CAFs بشكل موثوق لهذه الأغراض.

تتمثل التحديات الرئيسية في العزل الموثوق به للورم والخلايا الطبيعية من البيئات المكروية لنفس المرضى ، وعدم التجانس ، وعدم وجود علامات CAF محددة ، واللدونة CAFs ، والنماذج المحدودة في المختبر التي تلخص تعقيد TME. بطرق مماثلة ، قمنا بتمييز الدور الأساسي المؤيد للورم لعامل النسخ STAT3 والجينات المستهدفة في CAFs لسرطان الثدي الفأر ، مما يدل على فعاليتها كأهداف علاجية. العزل الأمثل للأرومات الليفية من الورم والمناطق الطبيعية المجاورة لعينات استئصال البروستاتا الجذري التي تم الحصول عليها من مرضى سرطان البروستاتا باستخدام كمية صغيرة من الأنسجة.

للبدء ، قم بوزن عينات الأنسجة على الميزان في اليوم الأول لعزل الخلايا الليفية. باستخدام ملقط معقم ، انقل الأنسجة إلى أطباق ستة سنتيمترات. اغسل الأنسجة مرتين في أربعة ملليلتر من الثلج البارد PBS ومرتين في أربعة ملليلتر من الثلج البارد DMEM كامل.

الآن ، انقل الأنسجة إلى صفيحة بطول ستة سنتيمترات على الجليد. أضف مليلتر واحد من DMEM المكمل بالمضادات الحيوية إلى الطبق. ثم استخدم المقص أو الشفرات لفرم الأنسجة إلى شظايا أصغر من ملليمتر مربع واحد.

انقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على خمسة ملليلتر من الثلج البارد DMEM الكامل. ثم قم بالطرد المركزي للتعليق عند 754 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. باستخدام ماصة 10 ملليلتر ، قم بإزالة المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من الثلج البارد ، وأكمل DMEM وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى. بعد إزالة المادة الطافية, أعد تعليق الحبيبات في محلول الكولاجيناز الثاني. انقل التعليق إلى أنابيب دقيقة سعة 1.5 مل.

أغلق الأنابيب الدقيقة بغشاء البارافين. ثم ضعها على حرارة 37 درجة مئوية للهضم طوال الليل مع التأرجح المستمر لمدة ثماني إلى 12 ساعة. في اليوم التالي ، انقل العينات المهضومة إلى أنابيب مخروطية 15 مليلتر.

ماصة خمسة ملليلتر من الثلج البارد كاملة DMEM لتعطيل الكولاجيناز. ثم قم بالطرد المركزي للتعليق عند 754 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من 0.05٪ trypsin-EDTA بعد إخراج المادة الطافية.

احتضان لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز العرضي. بعد ذلك ، قم بتعبئة ملليلتر واحد من محلول DNase I المحضر حديثا إلى العينات واخلطها جيدا. بعد الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من DMEM الكامل البارد وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.

أعد تعليق الخلايا الناتجة في DMEM كامل مكمل بمصل بقري الجنين بنسبة 20٪. قم بتسخين الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة لمدة ثلاثة أيام على الأقل. بعد ثلاثة أيام ، افحص الخلايا للتأكد من مورفولوجيا وقابلية للحياة.

بمجرد وصول الخلايا إلى التقاء الخلايا ، قم بتمريرها إلى طبق 10 سم يحتوي على DMEM كامل مع 20٪ مصل بقري الجنين. الخلايا الليفية المرتبطة بسرطان الصفائح أو الخلايا الليفية العادية عند التقاء 70٪ في 12 صفيحة بئر. في اليوم التالي ، أضف 0.45 جرام من أجار نقطة الانصهار المنخفضة إلى 12.5 مل من PBS في أنبوب مخروطي 50 مل في ظروف معقمة.

قم بإذابة الخليط باستخدام فرن الميكروويف. قم بتبريد محلول أجار حتى 37 درجة مئوية. ثم قم بتخفيفها بنسبة واحدة إلى أربعة باستخدام DMEM الكامل المسخن مسبقا لإعداد حل عمل.

استنشاق الوسط من لوحة 12 جيدا. ماصة 500 ميكرولتر من محلول أجار العمل في كل بئر. احتضان لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية للسماح بتصلب الأجار.

في هذه الأثناء ، احتفظ بمحلول الأجار المتبقي عند 37 درجة مئوية. قم بتريبسين الخلايا السرطانية وإعداد معلق خلية من 20 ، 000 خلية لكل مليلتر. امزج أحجام متساوية من معلق الخلية السرطانية ومحلول أجار للحصول على حجم نهائي يبلغ سبعة ملليلتر، وهو ما يمثل ثلاثة نسخ تقنية لكل حالة.

ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لضمان الخلط المتساوي. ثم قم بتوزيع 500 ميكرولتر من هذا الخليط الذي يحتوي على ما يقرب من 5000 خلية فوق الطبقة الأساسية الصلبة في كل بئر. بعد ترك الأجار يتجمد لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، أضف مليلترا واحدا من DMEM الكامل لكل بئر.

قم بتغيير الوسط كل يومين عن طريق الشفط برفق من حافة البئر وإضافة وسط طازج إلى المنتصف. احتضن حتى تصبح المستعمرات مرئية بسهولة. بمجرد ظهور المستعمرات ، تخلص من وسط الاستزراع.

ثم تلطيخ المستعمرات ب 200 ميكرولتر من محلول كلوريد النيترو الأزرق رباعي الزوليم. احتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة. في اليوم التالي ، تخلص من محلول التلوين.

احصل على صور للمستعمرات الملطخة باستخدام مجهر ستيريو. تم عزل الخلايا الليفية النقية بنجاح. في كثير من الحالات ، لا سيما في الممرات المبكرة ، أظهرت الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان مورفولوجيا أكثر شبها بالمغزل مقارنة بالخلايا الليفية الطبيعية.

أكد التحليل الكمي أن تكاثر خلايا DU145 المعالجة بالوسائط المكيفة للخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان كان أعلى بشكل ملحوظ على مدار 120 ساعة من تلك التي عولجت بالوسائط المكيفة للخلايا الليفية العادية أو تركت دون علاج. كما أظهرت خلايا DU145 المزروعة مباشرة مع الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان والخلايا الليفية الطبيعية زيادة في الانتشار على مدى 96 ساعة مقارنة بالضوابط. أظهرت منحنيات النمو المقابلة أن الزراعة المشتركة مع الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان والطبيعية أدت إلى زيادة مماثلة في انتشار DU145 بمرور الوقت.

اختلف تأثير الوسائط المكيفة على تكاثر DU145 عبر أزواج الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان وأزواج الخلايا الليفية الطبيعية مع أزواج المرور المبكرة التي تظهر تأثيرات أقوى بكثير من الأزمات اللاحقة. في فحوصات تكوين مستعمرة أجار ناعمة ، زادت كل من الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان والطبيعية من عدد وحجم مستعمرات DU145 مقارنة بالضوابط ، مما يشير إلى تعزيز النمو المستقل عن التثبيت. منعت طبقات الخلايا الليفية المنفصلة التي تشكلت بسبب مشاكل فنية تكوين المستعمرة في بعض التكرارات.

لم تعزز الوسائط المشروطة وحدها تكوين مستعمرة مستقلة عن المرسى في خلايا DU145.