تسلسل Amplicon باستخدام تقنيات التسلسل طويل القراءة

أبحث فيما إذا كان التسلسل المحمول طويل القراءة يمكن أن يوفر نتائج قابلية للأدوية في بيئات محدودة الموارد بدقة مماثلة لطريقة المعيار الذهبي، مما يعزز تشخيصات السل عالية الجودة وسهلة الوصول إليها. باستخدام التسلسل المستهدف من الجيل القادم كأداة تشخيصية لمرض السل المقاوم للأدوية من خلال تقديم ملف مقاومة شامل مباشرة من عينة سريرية دون خبرة في المعلوماتية الحيوية. بروتوكولنا الذي يستخدم تسلسل القراءة الطويلة لديه القدرة على توفير أوقات استجابة أسرع، وسير عمل أبسط مقارنة بالكشف عن المقاومة في الوقت الحقيقي، مما يسهل تشخيصات السل الشاملة، ويعزز تتبع التفشي في بيئة محدودة الموارد مع بنية تحتية محدودة.

للبدء، احسب 100 نانوجرام من كل عينة أمبليون بناء على التركيز وانقل الحجم المطلوب إلى أنبوب PCR نظيف. لتحديد الكتلة الكلية للمضخمات في العينة، استخدم الصيغة المعطاة. اضبط الحجم الكلي لكل عينة إلى 12.5 ميكرولتر باستخدام ماء خال من النوكليز.

اخلط العينات بلطف عن طريق التوصيل بأنبوب 10 مرات وقم بدورانها لفترة وجيزة في جهاز الطرد المركزي الدقيق. بعد ذلك، أضف 1.75 ميكرولتر من محلول إصلاح الأطراف ومحلول تفاعل الأدينيل لكل عينة، يليه 0.75 ميكرولتر من خليط إنزيم إصلاح الأطراف والأدينيل. بعد خلط وتدوير العينات، ضع الأنابيب في جهاز تدوير حراري على درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، تليها 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

للحصول على الربط الأصلي بالباركود، أضف المكونات المعروضة على الشاشة في أنابيب PCR الجديدة. اخلط التفاعلات بلطف عن طريق التسرب ولف لفترة وجيزة باستخدام جهاز الطرد المركزي الدقيق. بعد ذلك، أضف ميكرولتر واحد من EDTA إلى كل أنبوب.

ثم اخلط جيدا وادور لفترة وجيزة كما هو موضح سابقا. اسحب العينات المشفرة شريطيا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليتر. قم بعمل دوامة على حبيبات تنظيف الحمض النووي لإعادة تعليقها بالكامل وإضافة حجم يساوي 0.7 ضعف حجم العينة المجمعة.

اخلط محلول عينة الخرزات وحضنه على جهاز هولا ميكسر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، لتحضير ملليترين من الإيثانول بنسبة 80٪، اخلط 1,600 ميكرولتر من الإيثانول النقي مع 400 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة خمس دقائق حتى يصبح اللوات شفافا وعديم اللون.

ثم أزل وتخلص من السوبرناتينت دون إزعاج الحبيبة. اغسل الخرزات ب 700 ميكرولتر من الإيثانول الطازج المحضر 80٪ ثم قم بعمل الطرد المركزي في الأنبوب لفترة وجيزة. بعد وضع الأنبوب على الرف المغناطيسي، أزل الإيثانول المتبقي.

الآن، أزل الأنبوب من الرف المغناطيسي. أعد تعليق الخرزات في 35 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز عن طريق النقر الخفيف وحضنه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أعد الأنبوب إلى الرف المغناطيسي حتى يصبح اللوات شفافا وعديم اللون.

ثم انقل 35 ميكرولتر من الإليوات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف بسعة 1.5 ملليلتر لاستخدامه لاحقا. لربط المحول، اخلط المكونات المعطاة في أنبوب طرد مركزي منخفض الارتباط بسعة 1.5 ملليتر. قم بعمل طرد مركزي للأنبوب لفترة وجيزة وحضن الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

قم بعمل دوامة لتنظيف الحمض النووي لإعادة تعليقها بالكامل. أضف 20 ميكرولتر من الخرزات إلى الأنبوب وامزج برفق. حضن على جهاز هولا ميكسر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لدفع الخرزات وسحب الفائق دون إزعاج الحبيبة. أضف 125 ميكرولتر من مخزن الشظايا القصير وحرك الأنبوب بلطف لإعادة تعليق الخرز. قم بجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة وأعد الأنبوب إلى الرف المغناطيسي.

استنشق السوبرناتانت مرة أخرى بعد أن تتجمع الخرزات. الآن، أزل الأنبوب من الرف المغناطيسي وأعد تعليق الخرزات في 15 ميكرولتر من مخزن الإزالة عن طريق التوصيل الخفيف أو التحريك. قم بعمل طرد مركزي مؤقت للأنبوب لجمع المحتويات، ثم حضنه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لاستخراج الحمض النووي.

ضع الأنبوب على رف مغناطيسي حتى يصبح الشفاف عديم اللون. ثم استنشق 15 ميكرولتر من الإيلوات وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف بسعة 1.5 ملليتر. لتحضير محلول تمهيد خلية التدفق، اخلط المكونات المعطاة جيدا.

افتح منفذ التحضير لخلية التدفق، واسحب حوالي 20 ميكرولتر من المخزن لإزالة فقاعات الهواء، وحمل 800 ميكرولتر من خليط التمهيدي في المنفذ دون إدخال فقاعات هواء. لتحضير مكتبة الحمض النووي، قم بمزج المكونات المعروضة على الشاشة بشكل جيد. ارفع غطاء منفذ العينة في خلية التدفق، وحمل 200 ميكرولتر من خليط التمهيدي في منفذ التمهيدي دون إدخال فقاعات هواء.

بعد خلط مكتبة الحمض النووي المحضرة، قم بتحميل 75 ميكرولتر من المكتبة بشكل إسقاطي في منفذ عينة خلية تدفق التسلسل. أغلق غطاء منفذ عينة خلية التدفق، مع التأكد من دخول البانغ بأمان إلى منفذ العينة، ثم أغلق منفذ التحضير بإحكام. أكد الرحلان الكهربائي الهلامي سلامة الأمبلكونات في جميع العينات تقريبا، لكن المسارات المقابلة للعينات 89 و136 أظهرت نطاقات باهتة أو غائبة.

كانت العينتان 89 و136 تحتوي على تركيزات أمبلكون غير كافية، مما أدى إلى استبعادهما من تسلسل القراءة الطويلة. عبر جميع الجينات المستهدفة، حققت منصات القراءة الطويلة والقصيرة أعماق تغطية عالية، حيث أظهر جين EIS أعلى القيم المتوسطة وجين RRS أدنى أعماق تغطية. على الرغم من اختلاف عمق التغطية، حافظت كلتا المنصتين على تغطية عالية بلغت 99.9٪ عبر جميع الجينات المرتبطة بالمقاومة.

تم اكتشاف متغيرات مقاومة الأدوية للإثامبوتول، فلوروكينولونات، كانامايسين، أميكاسين، وكابريومايسين بتطابق 100٪ عبر منصات التسلسل قصير وطويل القراءة. لم يتم العثور على طفرات مرتبطة بالمقاومة للينزوليد، بيداكويلين، وكلوفازيمين باستخدام أي من نهجي التسلسل. أظهر اكتشاف مقاومة الستربتوميسين توافقا أقل بين المنصات، حيث لم يتفق إلا بنسبة 71.43٪.

تراوحت حساسية الكشف للجينات الرئيسية rpoB، katG/fabG1/ahpC/inhA، fabG1/inhA، وpncA بين 89.47٪ و96.77٪ بين المنصات المختلفة.