تصور عضوي الشبكية بالكامل مع الدقة الخلوية

يركز عملنا على تطوير ودراسة عضيات الشبكية التي تعمل كنموذج بشري في المختبر لدراسة كيفية تشكل شبكية العين البشرية ، وكيف تؤثر الأمراض ، وكيف يمكننا علاجها.

للمضي قدما في البحث في مجال الطب التجديدي ، نستخدم عضيات الشبكية ثلاثية الأبعاد جنبا إلى جنب مع المقاصة البصرية ووضع العلامات المناعية لتصور الهياكل بأكملها ودراسة التنظيم الخاص لخلايا الشبكية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.

يواجه التصوير الكامل تحديات ، مثل تغلغل الأجسام المضادة غير المتكافئ في الأنسجة الكثيفة والانحراف الكروي في الأعضيات ، مما يتسبب في وضع العلامات على التحيز السطحي وفقدان التركيز أثناء تصور الأنسجة.

تكشف طريقتنا عن اتصالات خلايا الشبكية ، وأنواع الخلايا ، تحت تنظيم ثلاثي الأبعاد ، مما يوفر رؤى حاسمة حول الأسباب الكامنة وراء أمراض الشبكية.

[مدرب] للبدء ، احصل على أليكوت الفلوروفور المذابة في DMSO اللامائي ، المجففة والمجمدة. أضف 1 إلى 10 ميكرولتر من DMSO إلى الحصة. الآن ، اجمع بين 50 ميكرولتر من الغلوبولين المناعي الثانوي G أو الجسم المضاد الأولي ، وستة ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم المولار ، وواحد إلى خمسة ميكرولتر من الفلوروفور ، واحتضان على منصة هزازة لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. أثناء تقدم التفاعل ، قم بإزالة أغطية أعمدة استبعاد حجم التنقية واسمح للمخزن المؤقت بالمرور. قم بموازنة العمود عن طريق تشغيل ثلاث جولات من ملليلترين إلى ثلاثة ملليلتر من PBS عبر العمود. إذا انتهى التوازن الأخير قبل انتهاء الحضانة ، فضع الأغطية مرة أخرى لتجنب رسمها ، وانتظر حتى ينتهي رد الفعل. بعد الحضانة ، أضف 140 ميكرولتر من PBS إلى تفاعل وضع العلامات لرفع الحجم إلى حوالي 200 ميكرولتر ، ودوامه. أضف الحل إلى وسط العمود واتركه يدخل العمود. بعد أن تراوغ القطرة الأخيرة ، ادفع المحلول ب 550 ميكرولتر من PBS. عندما يتوقف السائل عن السقوط ، قم بإلقاء 300 ميكرولتر من PBS ، واجمعه في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. قم بقياس امتصاص العينة عند 280 نانومتر ، وعند الأطوال الموجية الخاصة بالفلوروفور لحساب تركيز الأجسام المضادة ونسب الوسم. قم بتخزين الأجسام المضادة المصنفة على حرارة أربع درجات مئوية ، محمية من الضوء ، لمدة تصل إلى ستة أشهر. ثبت عضيات الشبكية مع 4٪ ألدهيد paraform في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. بعد التثبيت ، أضف محلول استرجاع المستضد فوق العضيات ، واحتضن الطبق على حرارة 60 درجة مئوية ، مع اهتزاز خفيف بمعدل 30 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بتخلل العضيات باستخدام PBS الذي يحتوي على 1٪ Triton X-100. احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة مع رج خفيف لمدة أربع ساعات. الآن ، قم بحظر العضيات في 2٪ BSA مع 0.1٪ Triton X-100 في درجة حرارة الغرفة طوال الليل أو لأكثر من يوم واحد. في اليوم التالي ، أضف الأجسام المضادة الأولية المخففة إلى الأعضيات. احتضان على حرارة أربع درجات مئوية لمدة يومين مع اهتزاز خفيف. اغسل العضيات ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة في محلول الغسيل في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز خفيف. الآن ، أضف الأجسام المضادة الثانوية لمحلول التخفيف واحتضان عند أربع درجات مئوية لمدة يومين مع اهتزاز خفيف. بعد غسل العضيات كما هو موضح سابقا ، احتضن العضيات بأصباغ الفلورسنت المخففة في محلول الغسيل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز خفيف. ثم اغسل مرة أخرى. بعد ذلك ، قم بإعداد محاليل 1-بروبانول في ماء فائق النقاء بتركيزات 15٪ و 30٪ و 45٪ و 60٪ و 75٪ و 90٪ ، واضبط كل منها على درجة الحموضة 9.5 مع ثلاثي ميثيل أمين. قم بتجفيف العينات بالتتابع في زيادة التدرجات لمحاليل 1-بروبانول لمدة ساعتين عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف. ثم انقل العينة إلى محلول 1-بروبانول 100٪ ، واحتضنها طوال الليل عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف. لإزالة العينة ، قم بإعداد خليط كحول البنزيل وبنزوات البنزيل بنسبة واحدة إلى اثنتين لصنع محلول باب. اغمر العينات في باب في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. قم بتحديث محلول BABB قبل التصوير. باستخدام ماصة زجاجية ، ضع العضوي في طبق بتري ذو قاع زجاجي مع قطرة من BABB ، مما يضمن ملامسته لسطح زجاج الغطاء. الآن ، استخدم مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر المقلوب مع أهداف تكبير منخفضة وعالية للحصول على صور Z-stack للحصول على دقة خلوية ثلاثية الأبعاد. أعد معايرة حجم الخطوة للحصول على Z-stack من خلال حساب عدم تطابق معامل الانكسار بين محلول المقاصة ووسائط الغمر. الآن ، قم بتشغيل ImageJ ، وقم بتحديث عمق الفوكسل عن طريق تحديد صورة والنقر فوق خصائص لإنشاء إسقاطات صور ل Z-stack. افحص عمق المكدس Z عن طريق تحديد صورة، ثم مكدسات، واختيار طرق عرض متعامدة لعرض طرق عرض XY وXZ وYZ للجسم العضوي الشبكي. احفظ المناطق المطلوبة بالنقر فوق ملف وتحديد حفظ باسم. أخيرا ، قم بإنشاء رسم متحرك للعرض ثلاثي الأبعاد ل Z-stack باستخدام برنامج المعالجة. أظهرت عضيات الشبكية التي تم تطهيرها من الفركتوز الجلسرين أقل تحسن في الشفافية ، مما أعاق تصور اللب العضوي. أدى تطهير ECI إلى تحسين تصور طبقات الشبكية ، لكنه فشل في الكشف عن اللب العضوي بسبب تشتت الضوء المستمر. أظهرت العضيات التي تم تطهيرها من Fluoclear BABB أعلى شفافية ، وكشفت بوضوح عن كل من القشرة واللب مع مضان متسق. أظهر كل من ECI و fluoclear BABB العضيات التي تم تطهيرها انكماشا مرئيا في صور المجال الساطع بسبب خطوات الجفاف. أدى الانكماش الناجم عن BABB إلى زيادة انضغاط العينة ، مما يتيح استخدام أهداف عالية التكبير لتصوير الهياكل الأعمق. أظهر وضع العلامات المناعية TUJ1 في 40 يوما في المختبر طبقة عصبية رقيقة واحدة دون تقسيم طبقي مرئي. بحلول 90 يوما ، كانت الخلايا تسكن المنطقة القمية بكثافة ، وفي 170 يوما ، أظهر العضوي علامات واضحة على التنظيم متعدد الطبقات مع منطقة قمية محددة. في 200 يوم ، امتدت نتوءات الخلايا الممدودة إلى الداخل من السطح إلى القلب ، وتطورت العضوية إلى ثلاث طبقات متميزة في شبكية العين في 250 يوما. امتدت الألياف العصبية من المركز العضوي باتجاه المحيط عبر النضج ، وأصبحت أكثر سمكا وتعقيدا بمقدار 250 يوما في المختبر. ظهرت المستقبلات الضوئية المخروطية التي تعبر عن الأوبسين الأزرق والأخضر / الأحمر في مراحل متأخرة ، وأظهرت مورفولوجيا ممدودة بأطراف مشرقة. تم تحديد المستقبلات الضوئية للقضيب التي تعبر عن رودوبسين من خلال نواتها المركزية وتوزيع الأوبسين المحيطي. تم توزيع الخلايا إيجابية Chx10 في البداية على نطاق واسع ، ولكن تم توطينها لاحقا على وجه التحديد في الطبقة النووية الداخلية أثناء النضج العضوي. تم الحفاظ على تعبير GCaMP6s الداخلي بعد تطهير BABB ، مع إمكانية اكتشاف إشارة GFP في شبكية العين العصبية بعد التثبيت طويل الأمد.