الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال كتقنية تصور لتحليل اللدونة المشبكية اليومية في قشرة برميل الفأر

نحن مهتمون باللدونة العصبية ، ولا سيما التغيرات اليومية في مرونة نقاط الاشتباك العصبي والخلايا العصبية والخلايا الدبقية. نحن نحاول الإجابة على السؤال كيف تتحول نقاط الاشتباك العصبي أثناء النهار والليل وفي ظل ظروف مرضية. تتمثل أحدث التطورات في مجال دراساتنا في استخدام أدوات وراثية مختلفة للتلاعب بالتعبير الجيني ، وكذلك استخدام طرق لتصور التغيرات في الدماغ ، بالإضافة إلى وجود عدد متزايد من النماذج الحيوانية لدراسة الأمراض التنكسية العصبية. لقد وجدنا ، باستخدام مجهر نقل الإلكترون ، أن عدد نقاط الاشتباك العصبي في قشرة برميل الفئران يتغير أثناء النهار والليل. وهذا الإيقاع هو أيضا سيركادي ، على الأقل في حالة المشابك المثبطة. لأن نقاط الاشتباك العصبي المثبطة ، فإنها تزداد في العدد أثناء الليل ، بينما تزداد نقاط الاشتباك العصبي ضادات خلال النهار. تغييرات مماثلة وجدناها في دماغ ذبابة الفاكهة. في هذا النوع ، يتغير أيضا عدد نقاط الاشتباك العصبي خلال النهار والليل. وبالإضافة إلى ذلك ، وجدنا تغيرات هيكلية في شكل الخلايا العصبية والخلايا الدبقية.

[راوي] للبدء ، خذ مخيخ الفأر وقسم الدماغ إلى نصفي الكرة الأرضية. اختر نصف كرة أرضية واحدا وقم بتوجيهه بحيث يمكن قطع الأقسام بشكل عرضي إلى قشرة الأسطوانة. بعد ذلك ، قم بقص الأقسام بسمك 60 ميكرومتر ، وانقلها إلى محلول يحتوي على عازلة فوسفات 0.1 مولار ومثبت بنسبة واحد إلى خمسة. افحص الأقسام تحت المجهر الضوئي ، واجمع فقط تلك الأقسام التي تظهر بوضوح قشرة مجال البرميل. باستخدام فرشاة الرسم ، انقل الأقسام برفق إلى طبق زجاجي صغير بتر. اشطف أقسام الدماغ في 0.1 مولار. بعد ذلك ، قم بتثبيت الأقسام في 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم في مخزن مؤقت كاكوديليت 0.1 مولار مع 1.5٪ فيريسيانيد البوتاسيوم. بمجرد شطف الأقسام بالماء المقطر ، استخدم حقنة بفلتر 25 ملم لتوزيع 70٪ إيثانول يحتوي على 1٪ أسيتات اليورانيل ببطء في كل طبق بتري مع مناديل. بعد الحضانة طوال الليل في 70٪ إيثانول عند أربع درجات مئوية ، اغسل المناديل في 80٪ و 90٪ و 100٪ إيثانول. ثم اغسل الأنسجة مرتين بأكسيد البروبيلين لمدة 10 دقائق لكل منهما. بعد ذلك ، استبدل أكسيد البروبيلين بملليلترين من خليط واحد إلى واحد من راتنج بولي / سرير وأكسيد البروبيلين. غطيها بغطاء واحتضنها لمدة 40 دقيقة. قم بتضمين أقسام الدماغ في ملليلترين من خليط ثلاثة إلى واحد من راتنج بولي / سرير وأكسيد البروبيلين. غطيه واتركيه لمدة 1.5 ساعة. بعد ذلك ، قم بتقطيع فيلم ACLAR إلى قطع تتناسب مع حجم الشريحة الزجاجية القياسية. باستخدام ماصة بلاستيكية ، ضع كمية صغيرة من الراتنج على كل قطعة فيلم ACLAR. باستخدام فرشاة الرسم ، انقل أقسام الدماغ من طبق بتري إلى الراتنج الموجود على فيلم ACLAR. قم بتضمين كل قسم بين فيلمين من أفلام ACLAR ، واحتضان للبلمرة. باستخدام مجهر ضوئي بهدف مرتين ، قم بتصوير أقسام الدماغ المضمنة. لفتح الصور، انقر فوق ملف وفتح، وحدد الصور أثناء الضغط على مفتاح Shift، ثم انقر فوق فتح. ابدأ في تكديس الصور من القشرة. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الطبقة 1 في كل صورة ، وحدد طبقة مكررة ، وأدخل رقم الصورة كاسم في مربع الحوار. اختر صورة واحدة كملف الوجهة وانقر فوق موافق. بعد ذلك ، استخدم أداة Move لمحاذاة الصور يدويا ، واضبط الاتجاه باستخدام Edit أو Transform أو Rotate أو Flip حسب الحاجة. للحصول على تعديلات أكثر دقة، استخدم تحرير وتحويل وتشويه وتحريك الزوايا بشكل فردي لمطابقة المعالم التشريحية. اضبط وضع المزج للطبقة العليا على التراكب في لوحة Layers لتسهيل المحاذاة. في كل قسم يعرض قشرة الأسطوانة ، استخدم مجهر ستيريو لتحديد البرميل المحدد ، وقم بقصه مع البرميل المجاور باستخدام شفرة حلاقة. بعد تضمين القسم في كتلة الراتنج ، قم بتجميع الأقسام الرقيقة جدا على شبكات النيكل أحادية الفتحة المطلية ب Formvar. بعد محاذاة مكدس صور TEM كما هو موضح سابقا، حدد منطقة التحليل. انقر فوق Layer متبوعا ب New و Layer ، ثم انقر فوق OK. حدد أداة Rectangle ، وانتقل إلى Layer ، و Layer Style ، و Stroke. اضبط لون الحد وسمكها وموضعها إلى الداخل، ثم انقر فوق موافق. الآن ، ارسم مستطيلا لتحديد حدود التحليل ، وحدد تعبئة 0٪. لإضافة طبقة جديدة للتعليقات التوضيحية، حدد Layer، New، Layer، ثم انقر فوق OK. استخدم أداة Brush لتمييز نقاط الاشتباك العصبي على هذه الطبقة. استخدم أداة Zoom وأداة Hand لضمان الدقة أثناء التعليق التوضيحي. الآن ، افتح مكدس الصور المخصص لإعادة بناء 3D. حدد أداة Crop ، وحدد المنطقة التي تحتوي على العمود الفقري الشجيري عبر المكدس ، واضغط على Enter لاقتصاص تلك المنطقة في جميع الطبقات المرئية. لجعل طبقة واحدة فقط مرئية في كل مرة، قم بتبديل أيقونة العين في لوحة Layers. انقر فوق ملف، حفظ باسم، قم بتسمية الملف، حدد تنسيق JPG، وانقر فوق موافق لحفظ كل صورة تم اقتصاصها على حدة. افتح برنامج إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد. قبل التحميل، انقر فوق Z على أداة التنقل أو اضغط على اللوحة الرقمية 7 لمحاذاة منظور إطار العرض. بعد ذلك ، لتحميل الصور ، انقر فوق إضافة ، صورة ، مرجع ، ثم حدد الصورة الأولى وانقر نقرا مزدوجا للتأكيد. لوضع صورة TEM النهائية على طول المحور z ، انقر فوق الصورة. في لوحة Object Properties على الشريط الجانبي الأيمن، أدخل القيمة المناسبة في حقل Location Z. لتوزيع كل الصور بالتساوي على طول المحور z، حدد كل كائنات الصورة. اضغط على "إنهاء" لفتح لوحة "إنهاء". انتقل إلى علامة التبويب تحرير وانقر فوق توزيع Z لتباعدها تلقائيا بناء على سمك المقطع. لتحديد شكل العمود الفقري الشجيري يدويا على كل صورة TEM باستخدام منحنى واحد لكل صورة، انقر فوق إضافة ومنحنى ودائرة. لتحريك الدائرة، اضغط مع الاستمرار على g واسحب الماوس ثم انقر لتأكيد الموضع. اضغط مع الاستمرار على s لضبط الحجم، ثم انقر للتأكيد. بعد ذلك ، قم بقياس الكائن ليتماشى مع شكل العمود الفقري التغصني. الآن ، قم بتعديل الشكل المنحني ليناسب حدود العمود الفقري. حدد نقطة تحكم، واضغط على g، وحرك النقطة، وانقر للتأكيد. استخدم مفتاحي g أو s حسب الحاجة لضبط نقاط المقبض ، وتحسين اتجاه المنحنى وكثافته. لإضافة مزيد من التفاصيل، اضغط باستمرار على Shift وحدد نقطتي تحكم متجاورتين. ثم انقر بزر الماوس الأيمن واختر Subdivide لإدراج نقطة جديدة بينهما. بمجرد أن يحدد المنحنى العمود الفقري بدقة ، أدخل علامة التبويب Layout ، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق كائن دائرة Bezier ، واختر Duplicate Object دون تحريك الماوس. لتوصيل حواف الكائن المرتبط وتشكيل شبكة مغلقة، أدخل علامة التبويب النمذجة. اضغط على 2 للتبديل إلى وضع تحديد الحافة. انقر فوق تحديد، الكل، انقر بزر الماوس الأيمن، واختر Bridge Edge Loops لربط حلقات الحواف معا. لملء الفجوة الموجودة أعلى الكائن، قم بإلغاء تحديد الكل بالنقر بجانبه. اضغط مع الاستمرار على Alt وانقر على حافة واحدة من الحافة العلوية لتحديد الحلقة بأكملها. انقر بزر الماوس الأيمن واختر Extrude Edges ، واسحب لأعلى على طول المحور z. الآن ، اضغط على s ، وحرك الماوس للداخل لتقليص الحلقة الجديدة ، وانقر للتأكيد. مع استمرار تحديد الحلقة ، انقر بزر الماوس الأيمن واختر وجه جديد من الحواف. لتنعيم الهيكل النهائي ، انتقل إلى علامة التبويب المعدلات على الشريط الجانبي الأيمن. انقر فوق إضافة معدل، وانتقل إلى إنشاء، وحدد سطح التقسيم الفرعي. اضبط إطار العرض ومستوى العرض على مستوى واحد لتنعيم متسق. لتعيين لون للهياكل الفردية، حدد الكائن المطلوب. افتح علامة التبويب Material على الشريط الجانبي الأيمن ، وانقر فوق جديد ، وقم بتعيين اللون الأساسي. حدد كائن الضوء لضبط إضاءة المشهد. اضغط مع الاستمرار على g ، وحرك الماوس لتغيير موضع الضوء ، وانقر لتأكيد موقعه الجديد. لوضع الكاميرا للعرض، قم بتوجيه إطار العرض لمواجهة العمود الفقري المتغصني كما يجب أن يظهر في الإخراج النهائي. اضغط على Control + Alt + اللوحة الرقمية 0 لمحاذاة الكاميرا إلى العرض الحالي. اضبط إطار الكاميرا عن طريق تحديده مع الاستمرار مع الاستمرار في g وتحريكه لتحسين الإطار. كان من الممكن التعرف على القشرة الحسية الجسدية للفأر حتى في أقسام الدماغ غير الملطخة ، ويمكن إعادة بناء حقل البرميل بأكمله باستخدام الأدوات الرقمية على الرغم من توزيع البراميل الفردية عبر أقسام متعددة. مكنت صور TEM الرقيقة للغاية المتتالية من التصنيف الموثوق به للمشابك إلى أنواع مثيرة أو مثبطة بناء على أدلة مرئية متسلسلة. سمحت إعادة البناء ثلاثي الأبعاد للعمود الفقري التغصني من الأقسام التسلسلية بتصور مورفولوجيا العمود الفقري ، والكشف عن أشكال مختلفة ، مثل الأشواك الرقيقة والفطر والقصيرة والمتوسطة. تم تحديد أشكال العمود الفقري بناء على القياسات ، بما في ذلك طول العمود الفقري وطول العنق وأقطار العمود الفقري والرأس والرقبة.