إنتاج نظام جسيمات يشبه فيروس SARS-CoV-2 للتحقيق في دورات الحياة الفيروسية في المختبر

نقدم بروتوكولا محسنا في المختبر لإنتاج جزيئات شبيهة بفيروس SARS-CoV-2 تحاكي الفيروس الأصلي عن كثب. يتيح هذا النهج التحقيق في العدوى الفيروسية ، والتجميع ، وآليات الخروج دون قيود الحاجة إلى مختبر من المستوى 3 للسلامة البيولوجية.

يركز بحثنا على فهم بيولوجيا فيروس SARS-CoV-2 ومحاولة العثور على أدوية ، لا سيما من الطب الصيني ضد SARS-CoV-2. يجب التحكم في جميع الدراسات الحية لفيروس SARS-CoV-2 في مختبر على مستوى السلامة الحيوية الثالث. وهذا القيد التجريبي يجعل دراسة SARS-CoV-2 ممكنة فقط في عدد قليل من الأرواح. ال [سرس-كف-2] حمى مثل طريقة عملية من الدراسة حول [سرس-كف-2] يمكن دون حد من سلامة حيوية مستوى ثلاثة مختبر, والقائمة قائمة ميلان إلى جانب طريقة مفيدة جدا.

[مدرب] للبدء ، قم بزرع ما يقرب من 3 ملايين خلية HEK-293T في صفيحة زراعة أنسجة قطرها 10 سم مع وسط DMEM كامل ، مكملة بنسبة 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة تقريبا. تحقق من طلاقة الخلية تحت المجهر. قم بتخفيف 60 ميكرولتر من PEI من محلول مخزون واحد ملليغرام لكل مليلتر مع وسيط خال من المصل للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 200 ميكرولتر. الآن ، خذ 200 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل وأضف 6.7 ميكروغرام من البلازميد N ، و 10 ميكروغرام من بلازميد Luc-T20 ، و 0.016 ميكروغرام من بلازميد S ، و 3.3 ميكروغرام من بلازميد M-IRES-E فيه. أضف محلول PEI المخفف برفق إلى المحلول الذي يحتوي على طلاء البلازميدات لبروتينات البنية الفيروسية واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. هذا هو حل التعداد. قم بإسقاط محلول التعداء بحذر على خلايا HEK-293T وقم بتدوير لوحة زراعة الأنسجة برفق لضمان الخلط الشامل. تبادل وسط زراعة الخلايا مع DMEM في منتصف كامل بعد ست ساعات من الإصابة ، واحتضان خلايا HEK-293T المنقولة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. اجمع المادة الطافية لخلايا HEK-293T المصابة ، والتي تحتوي على جزيئات شبيهة بفيروس SARS-CoV-2. قم بتصفية المادة الطافية التي تم جمعها من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر لإزالة الحطام الخلوي. هذا هو وسيط SC2-VLP. قم بزرع 40,000 خلية HEK-293T مع تعبير مستقر عن الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2 ، أو ACE2 ، TMPRSS2 في طبق 96 بئرا ، وأضف 50 ميكرولترا من وسط SC2-VLP. احتضان صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 96 بئرا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط من كل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا ، واغسلها مرة واحدة باستخدام 100 ميكرولتر من PBS المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. قم بتحليل خلايا HEK-293T المصنفة بخلايا ACE2 TMPRSS2 مع 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل السلبي ، وهز العينة برفق على شاكر مداري لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتدوير لوحة البئر 96 عند 4,000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد ، ثم انقل اللوحة على الفور إلى حمام جليدي. خذ 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفحص اللوسيفيراز المعاد تكوينه في صفيحة بيضاء جديدة غير شفافة سعة 96 بئرا ، وأضف 20 ميكرولترا من المحللة في كل بئر. تخلط لفترة وجيزة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات. قم بقياس إشارة التلألؤ باستخدام قارئ لوحة. بعد ذلك ، لتقييم تكوين وسط SC2-VLP ، أضف 1.36 مل من محلول PEG 8000 إلى 10 ملليلتر من وسط SC2-VLP. ضعي الخليط على شاكر مداري واخلطيهم ببطء عند أربع درجات مئوية طوال الليل. الطرد المركزي المحلول عند أربع درجات مئوية و 2,000 غرام لمدة 30 دقيقة. وجمع حبيبات SC2-VLP لتحليل النشاف الغربي. قم بزرع ما يقرب من 3 ملايين خلية HEK-293T بالتساوي في طبق استزراع زجاجي بقطر 15 ملم ، واسمح للخلايا بالالتصاق والنمو حتى تصل إلى حوالي 70٪ من التقاء. بعد نقل الخلايا كما هو موضح سابقا بكميات البلازميد المعدلة ، اغسل طبق المزرعة برفق مرتين باستخدام مليلتر واحد من PBS المثلج. أضف ملليلترا واحدا من محلول تثبيت الألدهيد الطالي بنسبة 4٪ في درجة حرارة الغرفة ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة. اغسل الخلايا مرتين لمدة خمس دقائق لكل منها بملليلتر واحد من PBS في درجة حرارة الغرفة ، وقم باختراق الخلايا بإضافة مليلتر واحد من 0.25٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق. مرة أخرى ، اغسل الخلايا مرتين لمدة خمس دقائق لكل منها بملليلتر واحد من PBS في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف ملليلترا واحدا من ألبومين مصل البقر بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة لمنع تفاعلات الأجسام المضادة غير المحددة. أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية لتغطية قاع الزجاج ، واحتضانه عند أربع درجات مئوية طوال الليل. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد الأساسي وغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها بملليلتر واحد من PBS في درجة حرارة الغرفة. الآن ، أضف محلول الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع التألق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS ، قم بتلطيخ النوى ب 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من محلول Hoechst في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أخيرا ، بعد غسل الخلايا باستخدام PBS ، لاحظ تلطيخ البروتين S أو العضية قبل الحصول على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر. يوضح هذا الشكل حساسية إنتاج SC2-VLP لكميات تعداء متفاوتة من البلازميد الذي يشفر بروتين السنبل. كان عيار SC2-VLP أعلى عندما تم نقل 0.016 ميكروغرام من بلازميد S وانخفض بشكل ملحوظ مع 0.16 و 1.6 ميكروغرام من البلازميد s. خفضت طفرة H1271 إلى E في بروتين السنبلة بشكل كبير من عيار SC2-VLP مقارنة بالنوع البري. أدت طفرة E1262 إلى H إلى انخفاض معتدل في عيار SC2-VLP ، بينما ألغت الطفرة المزدوجة E1262 إلى H و H1271 إلى E الإنتاج تماما. تم تقليل نطاقات البروتين S و S-2 كاملة الطول في E1262 إلى H والممرات المتحولة المزدوجة ، مقارنة بالنوع البري. تم أيضا تقليل كفاءة التعبئة والتغليف S في المسوخ E1262 إلى H و H1271 إلى E وتم إلغاؤها تقريبا في الطفرة المزدوجة. ظلت وفرة VLP دون تغيير إلى حد كبير عبر النوع البري وجميع طفرات S. بروتين S من النوع البري متمركز مع علامة رابطة الدول المستقلة جولجي GM130 ، ولكن ليس مع علامة ER Sec61 beta أو علامة ERGIC ERGIC 53. أظهر بروتين H1271 إلى E المتحولة S توزيعا سيتوبلازميا منتشرا ويفتقر إلى التحديد المشترك مع GM130.