استخراج حمض النيوكسي ريبونوكلييك من الجينوم الكامل من أنواع البكتيريا المتفطرة عبر تقنية بروميد سيتيل تريميثيل أمونيوم

تركز أبحاثنا على التوصيف الجيني للأنواع الفطرية البكتيرية والطبيعة المعقدة لأمراض الفطريات في الإنسان. نولي تركيزا خاصا على البكتيريا الفطرية غير السلية وتفاعلاتها مع البلاعم أثناء العدوى المشتركة مع أنواع أخرى، وخاصة البكتيريا الدقيقة السل. بالإضافة إلى ذلك، نركز على تكوين أنواع البكتيريا الميكوبكتيرية الممرضة، والتعرف على الجينات المرتبطة بالضراوة، وتعدد أشكال النيوكليوتيد الواحد المرتبط بمقاومة الأدوية.

بسبب جدار الخلية السميك وجدران الخلايا الدهنية والكارهة للماء في البكتيريا المتفطرة، كان استخراج الحمض النووي تحديا ويتطلب تقنيات تحليل متخصصة لتفكيكها وإطلاق الحمض النووي الجيني بكفاءة. في بروتوكولنا، نتناول استخراج الحمض النووي من أنواع البكتيريا الفطرية باستخدام طريقة CTAB كطريقة قوية وفعالة لإنتاج حمض نووي عالي الجودة مناسب لجميع تقنيات تسلسل الجينوم والتقنيات الجزيئية الأخرى. للبدء، قم بالحرارة بقتل الزراعة السائلة التي تأخذ في أنبوب سعة 15 ملليلتر عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

ثم ضع أنبوب 15 ملليلتر في جهاز الطرد المركزي وادار على 3 220 جرام لمدة 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ماصة معقمة، تخلص من السوبرناتانت الشفاف، مع التأكد من إزالة جميع الوسائط. أعد تعليق حبيبة الزراعة بالكامل في 300 ميكرولتر من مخزن Tris-EDTA، وانقل الحبيبة المعلقة إلى أنبوب بسعة 2 ملليتر.

الآن، أضف 100 ميكرولتر من محلول الليزوزيم بتركيز 10 ملليغرام لكل ملليلتر إلى الأنبوب وامزجه بالضغط على الإنبات لأعلى وأسفل خمس مرات. انقر على الأنبوب بلطف لضمان التشتت الموحد، وضع الأنبوب في حاضنة دوار عند 37 درجة مئوية واحتضنه طوال الليل. في اليوم التالي، حضر خليطا من 5 ميكرولتر من بروتيناز K بتركيز 10 ملليغرام لكل ملليلتر و70 ميكرولتر من 10٪ SDS.

أضف 75 ميكرولتر من هذا الخليط إلى كل عينة. اخلط العينة عن طريق النقر على الأنبوب وحضانة الأنبوب على درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، مع عكس أو نقر الأنبوب بشكل متقطع للخلط. بعد ذلك، أضف 100 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم بوزن 5 أضرار إلى العينة، تليها 100 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم CTAB المسخن مسبقا إلى درجة حرارة 65 درجة مئوية للعينة.

اخلط العينة بالنقر حتى يصبح المحلول حليبيا. ضع الأنبوب في الحاضنة عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، مع قلب أو نقر الأنبوب بشكل متقطع لخلطه. الآن، أضف حجما مساويا، حوالي 675 ميكرولتر من محلول الكحول الإيزوأميل الكلوروفورم بنسبة 24:1 إلى العينة وامزج عن طريق النقر على الكحول.

ضع العينة في جهاز طرد مركزي وادار على حرارة 12,000 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، باستخدام ماصة، قم بسحب ما بين 550-600 ميكرولتر من الطور العلوي المائي بعناية في أنابيب معقمة بسعة 1.5 ملليتر ووضع عليها علامات مناسبة. أضف 550-600 ميكرولتر من الأيزوبروبانول البارد إلى كل أنبوب وامزج المحتويات عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.

ضع الأنبوب في فريزر مضبوطه على 20 درجة مئوية وحضنه لمدة 30 دقيقة إلى ساعة. بعد ذلك، قم بطرد مركزي للأنبوب بأعلى سرعة، حوالي 21 و130 جرام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة الحمض النووي غير القابل للذوبان. باستخدام ماصة، استنشق المادة الفائقة من الجانب الأمامي للأنبوب دون الإخلال بحبيبات الحمض النووي.

الآن، أضف 1,000 ميكرولتر من الإيثانول البارد بنسبة 75٪ إلى الحبيبة، وامزج العينة بقلب الأنبوب عدة مرات. قم بعمل طرد مركزي للعينة عند 12,000 جرام لمدة 30 دقيقة بنفس الاتجاه المستخدم سابقا. بعد الطرد المركزي، قم بسحب أو تفريغ كل الإيثانول دون إزعاج الحبيبة.

اترك الأنبوب ليجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة طوال الليل أو لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. ثم أضف بين 25-50 ميكرولتر من محلول Tris-EDTA عند pH 8 لإعادة تعليق الحمض النووي، وضع الأنبوب عند 4 درجات مئوية طوال الليل. بعد تقييم الجودة، ضع الأنبوب في فريزر مضبوط على 80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد.

تراوحت نسبة الحمض النووي التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة استخراج CTAB بين 190 نانوجرام لكل ميكرولتر و600 نانوجرام لكل ميكرولتر. تراوحت نسبة الامتصاص 260/280 بين 1.9 و2.0، ونسبة 260/230 بين 1.8 و2.2، مما يشير إلى وجود حمض نووي عالي النقاة. تم اكتشاف ذروة امتصاص واحدة عند 260 نانومتر.

أظهر الرحلان الكهربائي بجل الأغاروز لعينات عالية الجودة شريط DNA عالي الوزن الجزيئي سليم مع تحلل طفيف. في بعض أنواع البكتيريا الفطرية غير السلية، كان إنتاج الحمض النووي أقل من 50 نانوجرام لكل ميكرولتر وانخفضت نسب النقاء إلى ما دون النطاق المثالي، مما يشير إلى وجود تلوث.