قياس أحادي فوسفات الجوانوزين الدوري (cGMP) في الأنسجة الصلبة باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم التنافسي (ELISA)

يبحث مختبر Dechter في استقلاب أكسيد النيتريك. يحفز أكسيد النيتريك تكوين GMP الدوري من خلال سلسلة التوازن التكيفي. نهدف إلى معرفة كيف تؤثر الشيخوخة والنظام الغذائي والعوامل الأخرى على هذه الشلال. تركز الأبحاث السابقة على تكوين أكسيد النيتريك والتأثيرات الفسيولوجية الناتجة عن ذلك على إهمال الشلال الذي يربط بين الاثنين. يقيس بروتوكولنا GMP الدوري ، وهو رسول ثان في الشلال. بروتوكولنا بسيط ويمكن الوصول إليه وقابل للتكيف بسهولة مع أنواع الأنسجة المختلفة.

[راوي] للبدء،

ضع مطحنة المناديل والملقط والملعقة على الثلج الجاف لمدة 10 دقائق. قم بوزن فائض من أنسجة الخنازير لحساب الخسارة أثناء السحق. انقل الأنسجة إلى آلة الطحن المبردة الموضوعة على الثلج الجاف. قم بتجميد الأنسجة عن طريق صب النيتروجين السائل في آلة الطحن والسماح لها بالتبخر بالكامل قبل المتابعة. ثم استبدل غطاء آلة الطحن واضربها 15 مرة باستخدام مطرقة. الآن ، قم بوضع أنبوب الخالط من الخرزة على ميزان. باستخدام الملعقة المبردة والملاقط ، انقل الأنسجة المسحوقة إلى الأنبوب. ماصة 0.1 حمض الهيدروكلوريك العادي في أنبوب التجانس ، مما يضمن أن الحجم بالميكرولتر هو مضاعف كتلة الأنسجة بالمليغرام. ثم قم بتجانس عينة الأنسجة باستخدام خالط مطحنة الخرز. قم بالطرد المركزي للمتجانس عند 17,000 جم لمدة 30 دقيقة ، مع الحفاظ على درجة حرارة العينة أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية الناتجة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. جهاز طرد مركزي مرة أخرى لمدة 10 دقائق ، مع الحفاظ على درجة حرارة العينة أربع درجات مئوية. قم بإخراج جزء من المادة الطافية النهائية في أنبوب طرد مركزي دقيق وضعه على الجليد. بعد ذلك ، قم بماصة 9.9 ملليلتر من المخزن المؤقت ELISA في أنبوب يسمى Standard B. ماصة 100 ميكرولتر من محلول المخزون القياسي في الأنبوب B القياسي. دوامة تماما لضمان تعليق متساو. انقل 1,000 ميكرولتر من المحلول من المعيار B إلى الأنبوب المسمى المعيار 1. ثم أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت ELISA إلى الأنابيب المسماة بالمعيار 0 والمعايير من 2 إلى 8. دوامة قياسية 1. ثم انقل 500 ميكرولتر من المحلول إلى المعيار 2. ثم دوامة المعيار 2 ، ونقل 500 ميكرولتر من المحلول إلى المعيار 3. استمر في نقل 500 ميكرولتر من كل معيار سابق إلى المعيار التالي ، مع الدوامة تماما بعد كل إصدار حتى يتم إعداد المعيار 8. لأستيل العينات، أضف 50 ميكرولتر من هيدروكسيد البوتاسيوم بأربعة مولار إلى عينة 250 ميكرولتر. أضف على الفور 12.5 ميكرولتر من أنهيدريد الخليك. دوامة الحل لمدة 15 ثانية. ثم ماصة 12.5 ميكرولتر من أربعة أمولية هيدروكسيد البوتاسيوم والدوامة مرة أخرى. إلى الأنبوب المسمى قياسي 0 ، أضف 100 ميكرولتر من هيدروكسيد البوتاسيوم بأربعة أضعاف ، متبوعا على الفور ب 25 ميكرولتر من أنهيدريد الخل. بعد الدوامة ، قم بسحب 25 ميكرولتر من هيدروكسيد البوتاسيوم بأربعة أضرار في الأنبوب والدوامة لفترة وجيزة. كرر إضافات هيدروكسيد البوتاسيوم وأنهيدريد الخليك ، متبوعة بالدوامة للمعايير المتبقية ، وأضف نسبة محددة مسبقا من المخزن المؤقت ELISA وعينة الأسيتيلات إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. دوامة قياسية 0. انقل 50 ميكرولتر من المعيار 0 إلى خمسة آبار مخصصة على أنها آبار NSB و B من الصفيحة الدقيقة ELISA. ثم أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت ELISA إلى بئرين من NSB يحتويان على معيار 0. باستخدام طرف ماصة واحد، أضف 50 ميكرولتر من المعيار من 1 إلى 8 في الآبار المكررة، بدءا من المعيار 8 وانتقل إلى المعيار 1. دوامة كل عينة. ثم أضف 50 ميكرولتر إلى الآبار المناسبة بشكل مكرر أو ثلاثي. الآن ، ماصة 50 ميكرولتر من متتبع أسيتيل كولينستراز إلى جميع الآبار المعينة على أنها NSB و B naught و Standard و Tعينة أضف 50 ميكرولتر من مضاد المصل إلى كل B naught ، قياسي ، وعينة جيدة. غطي لوحة ELISA واحتضنها على حرارة أربع درجات مئوية لمدة 18 ساعة. بعد الحضانة ، اقلب لوحة ELISA فوق حاوية نفايات للتخلص من المحتويات. املأ الآبار بمخزن الغسيل باستخدام زجاجة غسيل. تحرك برفق لمدة خمس ثوان. ثم قم بتفريغ المخزن المؤقت للغسيل واضغط على السائل المتبقي على منشفة ورقية. الآن ، انقل كاشف Ellman إلى خزان. عند العمل بسرعة ، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 200 ميكرولتر من كاشف Ellman إلى الآبار الفارغة ، NSB ، B naught ، TA ، القياسية ، والعينة. أضف خمسة ميكرولتر من متتبع أستيل كولينستراز إلى بئر TA. ثم قم بتغطية لوحة ELISA ب Parafilm. ضعه في وعاء محمي بالضوء لاحتضانه في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لمدة 60 إلى 90 دقيقة. قم بإزالة البارافيلم وقراءة الكثافة البصرية عند 412 نانومتر كان تركيز GMP الدوري في كبد الخنزير في المجموعة الضابطة حوالي 0.0202 نانومول لكل جرام من الأنسجة. في المجموعة المعالجة بالنترات ، زاد تركيز GMP الدوري إلى حوالي 0.0364 نانومول لكل جرام من الأنسجة.