نمذجة عدوى الزائفة الزائفة المستمرة في يرقات أسماك الزرد المصابحة

العدوى المزمنة التي تسببها بكتيريا Pseudomonas aeruginosa تتحمل المضادات الحيوية ويصعب علاجها. هدفنا هو تطوير نموذج في الجسم الحي من شأنه تسريع اكتشاف العلاجات الفعالة. يتم فحص الأدوية المضادة للبكتيريا في الغالب في المختبر ، ويمثل اختبار الأدوية على الفئران المصابة بشكل مزمن تحديا معقدا. لسد الفجوة بين هذين النهجين ، نقترح نموذجا بديلا قبل السريري باستخدام يرقات أسماك الزرد الجريحة. نموذجنا للعدوى المستمرة في أسماك الزرد القائم على استخدام السلالة السريرية من Pseudomonas aeruginosa يعيد إنتاج تحمل المضادات الحيوية. في حين أن الحقن الدقيق يستخدم بشكل شائع لإصابة يرقات الزرد ، فإن طريقة الجرح لدينا تعكس وضع العدوى الطبيعي وهي مناسبة تماما لفحص المركبات العلاجية.

[راوي] للبدء ، ضع إبرا قياس 25 فوق عيدان لتسهيل التعامل معها. باستخدام مجهر ستيريو ، حدد وقم بإزالة الأجنة التي تظهر نموا غير طبيعي أو غير قابلة للحياة. حرك الطبق بحركة دائرية لتجميع الأجنة المتبقية في المنتصف. الآن ، استخدم إبرتين متوجهتين رأسيا لعزل كل جنين ، ووضع الإبرة اليسرى في الذيل للحفاظ على استقامة الجسم. باستخدام الإبرة اليمنى ، قم بعمل قطع واحد على حافة الحبل الظهري لإزالة الزعنفة. أكمل كل عملية قطع بسرعة ، مع ضمان غمر جميع الأجنة في محلول بكتيري في غضون 10 دقائق. بالنسبة لإجراء العدوى ، قم بتدوير محلول Pseudomonas aeruginosa تحت خزانة أمان بيولوجية من النوع الثاني ، وأضفه بمعدل 10 مرة تقريبا إلى قوة سبع وحدات تشكيل مستعمرة لكل مليلتر إلى صفيحة من ستة آبار. استخدم ماصة باستور زجاجية يمكن التخلص منها لجمع الأجنة المصابة ونقلها إلى المحلول البكتيري. احتضن لوحة الآبار الستة على حرارة 28 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. بعد الحضانة ، استرجع الأجنة المصابة وضعها تحت السلامة الميكروبيولوجية للغسيل. الآن ، انقل الأجنة بماصة زجاجية إلى 10 ملليلتر من ماء السمك بدون ميثيلين بلو ، مما يقلل من الحجم المنقول واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، انقل الأجنة مرة أخرى باستخدام ماصة زجاجية إلى أربعة ملليلتر من ماء السمك بدون ميثيلين أزرق ، واحتضان لفترة وجيزة. بعد ذلك ، باستخدام ماصة ، انقل الأجنة المصابة بشكل فردي إلى طبق مكون من 24 بئرا ، مع إضافة ملليلتر واحد من ماء السمك بدون ميثيلين بلو إلى كل بئر. ضع الطبق المكون من 24 بئرا في حاضنة على حرارة 28 درجة مئوية. قم بإعداد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مليلتر مع 95 ميكرولتر من 1X PBS لكل يرقة مصابة. انقل اليرقات إلى صفيحة بستة آبار تحتوي على أربعة ملليلتر من ماء السمك بدون ميثيلين بلو لغسل وإزالة بكتيريا العوالق. ضع كل جنين مغسول في أنبوب طرد مركزي دقيق مع PBS ، ونقل أقل قدر ممكن من السائل. الآن ، استخدم مدقة لسحق كل جنين على جانب أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، وترك المدقة داخل الأنبوب بعد ذلك. بعد ذلك ، ارفع المدقة وأضف 100 ميكرولتر من 2٪ PBS Triton لشطف البكتيريا المتبقية من المدقة ، وتحقيق تركيز نهائي بنسبة 1٪. دوامة الأنبوب واحتضان لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتوزيع ثلاث قطرات سعة 10 ميكرولتر من المحلل غير المخفف من كل جنين على ألواح أجار LB. استخدم ماصة متعددة القنوات لتخفيف كل محللة بشكل متسلسل في صفيحة مكونة من 96 بئرا تصل إلى 10 إلى قوة تخفيف ناقص ثلاثة. أخيرا ، قم بتوزيع ثلاث قطرات سعة 10 ميكرولتر من التخفيفات بجانب البقع غير المخففة. واحتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية. كانت جميع عزلات التليف الكيسي الأربعة Pseudomonas aeruginosa أقل ضراوة بشكل ملحوظ في نموذج الجنين المصاب مقارنة بالسلالة المرجعية PAO1. في الأجنة المصابة بعزلتين ، انخفض الحمل البكتيري بشكل ملحوظ على مدى ثلاثة أيام ، مما يشير إلى القضاء على البكتيريا. في المقابل ، حافظت العزلتان الأخريان ، B6513 و RP73 ، على حمل بكتيري مستقر نسبيا من 18 إلى 65 ساعة بعد الإصابة بعد الانخفاض الأولي ، مما يشير إلى الثبات. أدى العلاج القصير لمدة 30 دقيقة بالتوبراميسين بعد 1.5 ساعة من الإصابة إلى تقليل الحمل البكتيري بشكل كبير في الأجنة المصابة بعزلات B6513. لم يكن للتوبراميسين تأثير يعتد به على الحمل البكتيري عند إعطائه بعد 24 أو 48 ساعة من العدوى ، مما يدل على المقاومة خلال مراحل العدوى المستمرة.