Ookluc: خط برازموديوم بيرغي لتحديد المركبات التي تمنع انتقال العدوى

يهدف بحثنا إلى تحديد وتوصيف المركبات المانعة لانتقال العدوى والجينات الأساسية في المراحل الجنسية المتصورة باستخدام نظام عالي الإنتاجية لدعم الاستراتيجيات الجديدة لوقف انتقال الملاريا. يعالج هذا البروتوكول الافتقار إلى طرق موحدة وعالية الإنتاجية لتحديد المركبات التي تمنع الإرسال باستخدام خط P.berghei المعدل وراثيا مع الكشف الآلي عن طور التلألؤ لتطور الطفيليات بعد الإخصاب. يتيح هذا البروتوكول فحص المراحل الجنسية المتصورة ، ويكتشف المركبات المبكرة التي تمنع انتقال العدوى ، ويدعم التحديد الدقيق ل IC50 ، مما يوفر مزايا على الطرق التقليدية.

للبدء ، قم بإعداد عينات المركب عن طريق تخفيف مخزون المركب إلى مللي مولار واحد باستخدام وسط أوكينيت. قم بإعداد عينات العمل عن طريق تخفيف هذا المخزون البالغ طوله ملليمولار في وسط أوكينيت بنسبة واحد إلى 100 لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومولار. لمقايسة واحدة ، قم بإعداد حجم نهائي من 200 ميكرولتر من عينة العمل في نسخة.

إذا تم إذابة المركب في مذيب آخر غير الماء ، فقم بإعداد عينة تحكم عن طريق تخفيف المذيب في وسط الأوكينيت بنفس النسبة المستخدمة لعينة الاختبار. باستخدام لوحين سعة 96 بئرا ، ضع 80 ميكرولتر من كل عينة في آبار مخصصة للتحكم الإيجابي ، والتحكم السلبي ، والتحكم في المذيبات ، وعينات الاختبار في نسختين باتباع التصميم المحدد. أضف أربعة ميكرولتر من دم الفأر المتطفل إلى كل بئر بنسبة واحد إلى 20 ، باستثناء آبار التحكم السلبية.

قم بالتجانس برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. للتحكم السلبي ، أضف دم الفأر غير المصاب إلى كل بئر بنسبة واحد إلى 20 وقم بتجانس برفق عن طريق سحب العينات. ضع الأطباق في حاضنة مضبوطة على 21 درجة مئوية ، واحتضنها إما لمدة ست ساعات أو 24 ساعة.

بعد الحضانة، قم بتجانس كل عينة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل لضمان خلط الدم المناسب. قم بإعداد خليط المخزن المؤقت للتحلل والركيزة اللوسيفيراز بنسبة واحد إلى 50 مباشرة قبل الاستخدام. امزج خليط الركيزة العازلة للتحلل مع كل عينة بنسبة واحد إلى واحد ، مما يضمن خلطا لطيفا دون إدخال فقاعات.

احتضن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. الآن ، انقل العينات إلى لوحة بيضاء مسطحة القاع ذات 96 بئرا وقم بقياس اللمعان باستخدام قارئ لوحة. بعد فحص اللمعان ، سجل بيانات التلألؤ الخام التي يعرضها قارئ اللوحة.

باستخدام جدول بيانات ، احسب متوسط كل قياس باستخدام الصيغة المحددة. استبدل XX بعنوان خلية القياس الأولى و YY بعنوان خلية القياس الثانية. كرر الصيغة لجميع العينات.

قم بتحويل البيانات إلى تثبيط النسبة المئوية باستخدام الصيغة المحددة ، حيث A هي قيمة وحدة الضوء النسبية للعينة و B هي قيمة وحدة الضوء النسبية للتحكم. حدد المركبات التي تظهر تثبيطا أكثر من 95٪ لتحديد التركيز المثبط بنسبة 50٪. بعد إصابة الفئران ب Ookluc وجمع الدم المتطفل ، قم بإعداد عينات مركبة باستخدام وسط ookinete كمخفف عند التركيز الأولي الذي أظهر تثبيط التحويل بنسبة 100٪.

قم بلصق العينات ثلاث نسخ في صفيحة مكونة من 96 بئرا باتباع التصميم المحدد. باستخدام ماصة ، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية مزدوجة عن طريق نقل 80 ميكرولتر من البئر D1 إلى D2 ، والخلط جيدا ، ثم نقل 80 ميكرولتر من D2 إلى D3 ومواصلة هذه العملية حتى D12. تخلص من آخر 80 ميكرولتر تمت إزالته من D12 للحفاظ على 80 ميكرولتر لكل بئر.

الآن ، أضف دم الفأر الطفيلي إلى كل بئر بنسبة واحد إلى 20 وتجانس برفق عن طريق العينة. في آبار التحكم السلبية ، أضف دم الفأر غير المصاب بنسبة واحد إلى 20 وقم بتجانس برفق. ضع الطبق في حاضنة مضبوطة على 21 درجة مئوية ، واحتضنه لمدة ست أو 24 ساعة قبل إجراء فحص التلألؤ.

بعد حساب تثبيط النسبة المئوية ، افتح برنامج التحليل وأنشئ جدول XY للرسم. قم بتعيين المحور y لإدخال ثلاث قيم نسخ متماثل في أعمدة فرعية جنبا إلى جنب. الصق البيانات في الجدول بحيث يمثل x التركيز المركب و y يمثل تثبيط النسبة المئوية.

الآن ، انقر فوق تحليل. حدد الانحدار غير الخطي، ملاءمة المنحنى، ثم اختر منحنيات استجابة الجرعة، والتثبيط، متبوعا ب Inhibitor مقابل الاستجابة العادية، والميل المتغير، وانقر فوق OK. اعرض منحنى استجابة الجرعة على اللوحة اليسرى وقم بتطبيق التخصيصات ، مثل تغييرات اللون أو تنسيق النقطة.

حدد موقع جدول الملاءمة غير الخطي للعثور على فاصل الثقة IC50 المحسوب وفاصل الثقة 95٪. أظهر بيريميدين أزيبين 90 تثبيطا واضحا يعتمد على التركيز للنشاط المستهدف مع تثبيط أكبر من 95٪ لوحظ بتركيزات من 0.125 إلى ميكرومولار واحد ، وفقدان كامل للنشاط أقل من 0.007 ميكرومولار ، مما يشير إلى تأثير عتبة حاد في استجابته المثبطة. أسفر منحنى استجابة الجرعة المناسب لبيانات بيريميدين أزيبين 90 عن قيمة IC50 تبلغ 0.013 ميكرومولار ، مما يشير إلى فعالية عالية في تثبيط النشاط المستهدف.