Name: التشريح السريع والتفكك للظهارة الشمية للفأر للمعلقات أحادية النواة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: تعلم التشريح السريع للظهارة الشمية في الفئران لتسهيل دراسات تسلسل الحمض النووي أحادي النواة. يتيح هذا البروتوكول البحث في الأساس الجيني للجهاز الشمي بكفاءة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تمت الموافقة على جميع التجارب على في هذه الدراسة وإجراء وفقا لكلية بايلور للطب IACUC. تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6J (JAX: 000664). تفاصيل الكواشف والمعدات مدرجة في جدول المواد.
1. تشريح ظهارة حاسة الشم
<ol>
	<li>ابدأ بتخدير الفأر بعمق باستخدام أي طريقة مفضلة (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). تأكد من مستوى التخدير الجراحي عن طريق قرصة إصبع القدم الصلبة والمضي قدما في التروية عبر القلب بما لا يقل عن 10 مل من 1x PBS البارد. قم بإزالة الجلد لكشف الجمجمة (الشكل 2 أ). ملاحظة: إزالة الرأس من الجسم اختيارية. إذا قرر المرء إزالة الرأس ، فمن المستحسن إزالة الجلد والأنسجة الرخوة الأخرى حول الجمجمة قبل قطع الرأس.</li>
	<li>باستخدام زوج من المقصات الدقيقة ذات الرؤوس الحادة ، قم بعمل شقين لكسر الأقواس الوجنجية من العظم الحرشفية بشكل ثنائي عن طريق وضع طرف مقص واحد في المدار الخلفي والآخر مجاور للقناة السمعية (الخطوط الخضراء في الشكل 2 ب).</li>
	<li>قم بعمل شق ضحل من مدار إلى مدار على طول الجانب الأمامي للعظم الأمامي. شق السطح الظهري للعظم الأمامي فقط (~ 1-2 مم) ، مع الحرص على عدم قطع أي هياكل أو عظام أساسية تشكل المدار (الخط الأزرق في الشكل 2 ب). ملاحظة: لتحقيق شق ضحل بين المدارات ، أمسك المقص بشكل عمودي على الجمجمة واستخدم فقط الأطراف الحادة للقطع.</li>
	<li>قطع على طول خط الوسط للجمجمة من الثقبة الماغنوم ، من خلال الغرز السهمية والجبهية ، حتى يتم الوصول إلى الشق بين الحجاج الذي تم إجراؤه في العظم الأمامي في الخطوة 1.3 (الخط الأحمر في الشكل 2 ب).</li>
	<li>أدخل زوجا من الملقط في الشق الذي تم إجراؤه على طول خط الوسط للجمجمة واسحب نصف الكرة الأرضية من قبو الجمجمة بإحكام بشكل جانبي. سيؤدي هذا الإجراء أيضا إلى إزالة عظام المدار (الأمامية والفك العلوي والدمعية) ، مما يكشف الجوانب الجانبية للتوربينات الشمية (الشكل 2 د). ملاحظة: احرص على عدم إتلاف OE عن غير قصد من هذه النقطة فصاعدا.</li>
	<li>أمسك عظم الأنف والأسنان القاطعة ، وقم بفصل قبو الجمجمة المقابل باستخدام الملقط. اسمح للدماغ (بما في ذلك البصيلات الشمية) بإزالته بنصف الكرة الأرضية من العظم أثناء تمزيقه (الشكل 1E). الهياكل العظمية المرئية الوحيدة التي يجب أن تبقى بعد هذه الخطوة هي قاعدة الجمجمة والعظام المحيطة بالمعدات الأصلية (الشكل 2F).</li>
	<li>باستخدام زوج من كماشات العظام أو الرونجور ، قم بإزالة أي عظم أمامي متبقي وعظم ما قبل الفك العلوي (القاطع) حتى قاعدة الأسنان القاطعة (الشكل 2 ز).</li>
	<li>استخدم كماشات العظام لقطع الخيط الجبهي لتحرير عظم الأنف من الصفيحة المصفوية ، مع توخي الحذر الشديد حتى لا تتلف OE المكشوف الأساسي أو كسر الصفيحة المصفولة.</li>
	<li>ارفع عظم الأنف عن الصفيحة المصفوية باستخدام ملقط لفضح OE (الشكل 2H). إذا كان العظم قبل الفك العلوي المتبقي يحجب OE الظهري ، فقم بإزالته قبل المتابعة (دوائر سوداء في الشكل 1I).</li>
	<li>باستخدام ملقط رفيع الرؤوس ، قم بتأمين الجانب الظهري للحاجز الأنفي برفق عند تقاطعه مع الصفيحة المصفوية واسحبه للخلف (الشكل 2J ، K). مع الحد الأدنى من المقاومة ، سوف تتحرر الظهارة الشمية الرئيسية كهيكل سليم تماما (الشكل 2L).</li>
	<li>تابع على الفور تفكك OE أو قم بتجميد الأنسجة لمعالجتها لاحقا.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig2.jpg"> 
الشكل 2: تقنية التشريح السريع للظهارة الشمية. (أ) رأس الفأر بعد إزالة الأنسجة الرخوة المحيطة. (ب) أدلة مرمزة بالألوان لشقوق قبو الجمجمة. (ج) المظهر بعد شقوق القبو القحفية. (د) إزالة نصف الكرة الأول من قبو الجمجمة مع جزء المدار المجاور للظهارة الشمونية. (ه) إزالة الجزء المقابل من قبو الجمجمة مع الدماغ. (و) الرأس بعد إزالة الدماغ وقبو القحفة. (ز) إزالة العظم الأمامي الأمامي والفك العلوي الخلفي ، بعد شق في خياطة الجبهي الومامية. (ح) إزالة عظام الأنف. (I) تسلط الهالات السوداء الضوء على مناطق عظم ما قبل الفك العلوي المتبقية التي يمكن إزالتها اختياريا. (ي) وضع ملقط لإزالة الظهارة الشمية السليمة. (ك) اسحب للخلف لتحرير الظهارة الشمية. (L) الإطلاق الكلي للظهارة الشمية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
2. تفكك الظهارة الشمية وعزل النواة المفردة
<ol>
	<li>ضع أنبوبا C واحدا وأبوبين مخروطيين سعة 15 مل لكل عينة على الجليد.</li>
	<li>قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل عن طريق إضافة مثبط RNAse (إلى تركيز نهائي يبلغ 0.2 وحدة / ميكرولتر) إلى المخزن المؤقت لاستخراج النوى الجاهز.</li>
	<li>أضف 4 مل من 1٪ BSA إلى كل أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وقم بالدوامة لفترة وجيزة ، وتخلص من الفائض. هذا يغطي كل من الأنابيب المخروطية سعة 15 مل مع BSA لتقليل التصاق النوى بالأنبوب.</li>
	<li>للحصول على OE واحد كامل ، أضف 2 مل من محلول التحلل المثلج البارد إلى كل أنبوب C.</li>
	<li>أضف عينات OE إلى الأنابيب C. باستخدام ملقط # 2 ، أمسك كل عينة فوق الأنبوب C الخاص بها وقم بتقطيعها إلى قطع صغيرة باستخدام زوج من المقص ذي الطرف الرفيع.</li>
	<li>ضع الأنابيب C التي تحتوي على كل عينة رأسا على عقب على كتل فصل الأنسجة الآلية. على شاشة الفكك ، سيتغير المربع المقابل لكل كتلة من مجاني إلى محدد.</li>
	<li>اضغط على أيقونة المجلد للتنقل إلى مجلد Miltenyi . باستخدام الأسهم ، قم بالتمرير إلى برنامج 4C_nuclei_1 (برنامج محمل مسبقا داخل الفصل). اضغط على موافق لتطبيق البرنامج على كل كتلة ، ثم اضغط على ابدأ لبدء الدورة. قم بإزالة الأنابيب C من المفكك فور اكتمال الدورة. ملاحظة: إذا أمكن ، حافظ على الأنابيب C باردة أثناء دورة التفكك. من المهم إزالة العينات من الفصل فور اكتمال الدورة والمضي قدما في الخطوات التالية للبروتوكول لتجنب الإفراط في تحلل النوى.</li>
	<li>باستخدام ماصة، قم بشفط المعلق المتجانس من الأنبوب C وقم بتصفيته من خلال مصفاة سعة 70 ميكرومتر في أول أنبوب مخروطي مطلي ب BSA. تجنب شفط شظايا العظام التي تراكمت في الجزء السفلي من الأنبوب C.</li>
	<li>اشطف المصفاة ب 1 مل من 1x PBS المثلج لضمان الترشيح الكامل.</li>
	<li>جهاز الطرد المركزي التعليق المفلتر عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح.</li>
	<li>قم بالشفط برفق وتخلص منه ، مع الحرص على تجنب إزعاج الحبيبات. أعد تعليق حبيبات النوى تماما في 1 مل من 1x PBS المثلج عن طريق سحب العينة اللطيف.</li>
	<li>مرر النوى المعلقة عبر مصفاة 30 ميكرومتر إلى الأنبوب المخروطي الثاني المطلي ب BSA. يمكن قياس تركيز النوى باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.</li>
	<li>تابع على الفور بروتوكول المصب المختار (مع أو بدون FACS) للحفاظ على سلامة العينة ومنع التدهور (الشكل 3). ملاحظة: يوصى بشدة بأن يقوم المستخدمون بإجراء عمليات تشغيل تدريبية لهذا البروتوكول بأكمله لضمان إكماله بسلاسة وفي الوقت المناسب.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig3.jpg"> 
الشكل 3: تفكك الظهارة الشمية وسير عمل عزل النواة الواحدة. بعد التشريح ، يتم فصل الظهارة الشمية ميكانيكيا وكيميائيا. ثم يتم ترشيح المحللة من خلال مصفاة 70 ميكرومتر ، وشطفها ب 1x PBS ، وطردها بالطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. يتم تعليق الحبيبات في 1x PBS قبل تصفيتها من خلال مصفاة 30 ميكرومتر. يتوفر تعليق النوى الناتج لمختلف تطبيقات التسلسل النهائي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<ol><li>Graziadei, P. P. C., Graziadei, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+I.+Morphological+aspects+of+differentiation+and+structural+organization+of+the+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. I. Morphological aspects of differentiation and structural organization of the olfactory sensory neurons.</a> J Neurocytol. 8 (1), 1-18 (1979).</li>
<li>Monti Graziadei, G. A., Graziadei, P. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+II.+Degeneration+and+reconstitution+of+the+olfactory+sensory+neurons+after+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. II. Degeneration and reconstitution of the olfactory sensory neurons after axotomy.</a> J Neurocytol. 8 (2), 197-213 (1979).</li>
<li>Caggiano, M., Kauer, J. S., Hunter, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globose+basal+cells+are+neuronal+progenitors+in+the+olfactory+epithelium%3A+a+lineage+analysis+using+a+replication-incompetent+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Globose basal cells are neuronal progenitors in the olfactory epithelium: a lineage analysis using a replication-incompetent retrovirus.</a> Neuron. 13 (2), 339-352 (1994).</li>
<li>Iwai, N., Zhou, Z., Roop, D. R., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+basal+cells+are+multipotent+progenitors+in+normal+and+injured+adult+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Horizontal basal cells are multipotent progenitors in normal and injured adult olfactory epithelium.</a> Stem Cells. 26 (5), 1298-1306 (2008).</li>
<li>Schwob, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cells+of+the+mammalian+olfactory+epithelium%3A+Taking+poietic+license%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cells of the mammalian olfactory epithelium: Taking poietic license.</a> J Comp Neurol. 525 (4), 1034-1054 (2017).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+olfactory+stem+cell+trajectories+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Deconstructing olfactory stem cell trajectories at single-cell resolution.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 817-830.e8 (2017).</li>
<li>Gadye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+activates+transient+olfactory+stem+cell+states+with+diverse+lineage+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Injury activates transient olfactory stem cell states with diverse lineage capacities.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 775-790.e9 (2017).</li>
<li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+deconstruction+of+mouse+olfactory+sensory+neurons%3A+from+whole+mucosa+to+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: from whole mucosa to single-cell RNA-seq.</a> Sci Rep. 5 (1), 18178(2015).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+regulates+olfactory+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">p63 regulates olfactory stem cell self-renewal and differentiation.</a> Neuron. 72 (5), 748-759 (2011).</li>
<li>Brann, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neuronal+expression+of+SARS-CoV-2+entry+genes+in+the+olfactory+system+suggests+mechanisms+underlying+COVID-19-associated+anosmia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Non-neuronal expression of SARS-CoV-2 entry genes in the olfactory system suggests mechanisms underlying COVID-19-associated anosmia.</a> Sci Adv. 6 (31), eabc5801(2020).</li>
<li>Carter, L. A., MacDonald, J. L., Roskams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+horizontal+basal+cells+demonstrate+a+conserved+multipotent+progenitor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory horizontal basal cells demonstrate a conserved multipotent progenitor phenotype.</a> J Neurosci. 24 (25), 5670-5683 (2004).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Sci Rep. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Ruiz Tejada Segura, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+transcriptomics+atlas+of+the+mouse+nose+sheds+light+on+the+anatomical+logic+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A 3D transcriptomics atlas of the mouse nose sheds light on the anatomical logic of smell.</a> Cell Rep. 38 (12), 110547(2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+census+of+mammalian+olfactory+epithelium+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic census of mammalian olfactory epithelium aging.</a> Dev Cell. 59 (22), 3043-3058.e8 (2024).</li>
<li>Dunston, D., Ashby, S., Krosnowski, K., Ogura, T., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+manual+deboning+method+to+prepare+intact+mouse+nasal+tissue+with+preserved+anatomical+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization.</a> J Vis Exp. (78), e50538(2013).</li>
<li>Gurumurthy, R. K., Kumar, N., Chumduri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+isolation+of+high-quality+single+cells+from+the+female+mouse+reproductive+tract+tissues+for+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for isolation of high-quality single cells from the female mouse reproductive tract tissues for single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100970(2021).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).</li>
<li>Belfort, B. D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+AAV+serotypes+for+transduction+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of AAV serotypes for transduction of olfactory sensory neurons.</a> Front Neurosci. 19, 1531122(2025).</li>
<li>Huang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+olfactory+sensory+neurons+provide+behaviourally+relevant+sensory+input+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immature olfactory sensory neurons provide behaviourally relevant sensory input to the olfactory bulb.</a> Nat Commun. 13 (1), 6194(2022).</li>
<li>Barrios, A. W., Nunez, G., Sanchez Quinteiro, P., Salazar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy%2C+histochemistry%2C+and+immunohistochemistry+of+the+olfactory+subsystems+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Anatomy, histochemistry, and immunohistochemistry of the olfactory subsystems in mice.</a> Front Neuroanat. 8, 63(2014).</li>
<li>Antunes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+nasal+septa+for+respiratory+epithelial+air-liquid+interface+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures.</a> Biotechniques. 43 (2), 195-204 (2007).</li>
<li>Wu, J., Cai, Y., Wu, X., Ying, Y., Tai, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Bakulski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+the+gene+expression+effects+of+developmental+lead+%28Pb%29+exposure+on+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of the gene expression effects of developmental lead (Pb) exposure on the mouse hippocampus.</a> Toxicol Sci. 176 (2), 396-409 (2020).</li>
<li>Chang, C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+uncovers+the+individual+alteration+of+intestinal+mucosal+immunocytes+in+Dusp6+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing uncovers the individual alteration of intestinal mucosal immunocytes in Dusp6 knockout mice.</a> iScience. 25 (2), 103738(2022).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-sequencing+profiling+of+mouse+lung.+Reduced+dissociation+bias+and+improved+rare+cell-type+detection+compared+with+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-sequencing profiling of mouse lung. Reduced dissociation bias and improved rare cell-type detection compared with single-cell RNA sequencing.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).</li>
<li>Xiong, A., Zhang, J., Chen, Y., Zhang, Y., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+single-cell+transcriptomic+analyses+reveal+that+GPNMB-high+macrophages+promote+PN-MES+transition+and+impede+T+cell+activation+in+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM.</a> eBioMedicine. 83, 104239(2022).</li>
</ol>

ظهارة الفئران الشمية (OE) هي عنصر أساسي في الجهاز الشمي وهي مسؤولة عن اكتشاف وتحويل إشارات الرائحة إلى الجهاز العصبي المركزي. تحتوي الطبقة الأكثر سطحية على أهداب الكشف عن الروائح للخلايا العصبية الحسية الشمية ، والتي يتم تغطيتها بطبقة من المخاط وتحيط بها الخلايا الداعمة للخلايا الماسية والميكروفيلار1،2. OSNs ثنائية القطب ، وتمتد أهدابها قمية لتشكيل شبكة داخل الطبقة المخاطية وأكواسها بشكل أساسي من خلال الصفيحة العظمية المصفوية لتتحد في الكبيبات داخل البصلة الشمية. هذه الكبيبات هي موقع نقاط الاشتباك العصبي بين OSNs والخلايا العصبية النهائية. OSNs الأساسية ، تقوم الخلايا السلفية العصبية التي تسمى الخلايا القاعدية الكروية بتجديد OSNs باستمرار لأنها تموت3 بعد التعرض المباشر للإهانات البيئية مثل السموم المحمولة جوا ومسببات الأمراض والصدمات الجسدية. تشتق الخلايا القاعدية الكروية من مجموعة احتياطية من الخلايا القاعدية الأفقية متعددة القدرات4،5 ، وتقع بشكل أساسي وتلتزم بالصفيحة القاعدية للنتوءات العظمية التي تسمى القرينات الأنفية. التوربينات الأنفية متعرجة ، مما يجعل من الصعب فصل OE وتجانسه. علاوة على ذلك ، فإن OE محاطة بعظام الجمجمة ، مما يجعل الوصول إلى المنطقة صعبا ويتطلب تقليديا إجراء يستغرق وقتا طويلا.
اعتمدت الدراسات السابقة على حضانة غراء ممتدة لإطلاق الظهارة الشمية من العظم6،7،8،9،10 ، والتي يمكن أن تؤخر المعالجة النهائية لمعلق الخلية الواحدة. نظرا لأن قص محاور OSN يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج11 ، فإن تقليل مقدار الوقت من استخراج الأنسجة إلى إعداد مكتبة (كدنا) أمر ضروري. علاوة على ذلك ، فإن بنية OE وتوقعاتها على البصلة الشمية تعقد استخراج الخلايا السليمة من أجل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية الناجح. لحسن الحظ ، ظهر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) كأداة قوية لتنميط الخلايا مع الحفاظ على توزيع نوع الخلية ، لا سيما في الأنسجة التي يكون فيها تفكك الخلية المفردة صعبا أو غير عملي12،13.
في حين أن عددا من الدراسات6،7،8،10،14،15 قد أجرت تسلسل خلية واحدة لزراعة الفأر ، إلا أن أيا منها لا يقدم إجراء تشريح مفصل محسنا لجمع الأنسجة المتسقة والملائمة ، وهو أمر ضروري نظرا لهشاشة OE وتغليفها بعظام مختلفة من الجمجمة. بالإضافة إلى ذلك ، تركز أدلة التشريحالحالية 16 على الحفاظ على البنية التشريحية بدلا من السرعة ، مما يؤدي إلى أوقات تشريح طويلة محتملة. نظرا لأن تحضير الأنسجة الملائمة ضروري لتقليل تدهور الحمض النووي الريبي وتعظيم جودة النوىالمحضرة 17،18 ، فإن هناك ما يبرر بروتوكول محسن للتشريح السريع وتجانس OE للفئران في معلق أحادي النواة لاستخدامه في مختلف التطبيقات النهائية.
يقدم هذا البروتوكول (الشكل 1) طريقة مبسطة مصممة للتغلب على هذه التحديات ، مما يتيح التشريح السريع ل OE للفئران والتفكك الفعال للأنسجة لغرض عزل النوى. يسهل هذا النهج تسلسل نواة واحدة عاليالجودة 19 ، مما يوفر تقنية موثوقة للتحقيق في الأسس الجزيئية لبيولوجيا حاسة الشم.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig1.jpg"> 
الشكل 1: تشريح الغرز والعظام ذات الصلة بجمجمة الفأر C57BL / 6 والمقطع العرضي التمثيلي للظهارة الشمية. (أ) خيوط الجمجمة مرمزة بالألوان. يتم ترميز الغرز بالألوان على جانب واحد من الجمجمة ، بينما يترك الجانب الآخر بدون علامات للرجوع إليه (على اليسار). أسماء الغرز مرمزة بالألوان وفقا لذلك (يمين). (ب) عظام الجمجمة مرمزة بالألوان. يتم ترميز العظام بالألوان على جانب واحد من الجمجمة ، بينما يترك الجانب الآخر بدون علامات للرجوع إليها (على اليسار). أسماء العظام مرمزة بالألوان وفقا لذلك (يمين). (ج) المقطع العرضي للجزء المركزي من OE (تم تشريحه باستخدام الطريقة الموضحة في هذه المقالة) مع توربينات مرمزة بالألوان على جانب واحد والتركة فوقها غير مميزة للرجوع إليها (يسار). أسماء التوربينات المرئية (يمين). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table><tbody><tr><td>15 مل أنبوب الطرد المركزي</td><td>سيلتريت</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>القراص العظام &nbsp ؛</td><td>أدوات العلوم الجميلة</td><td>16102-11</td><td></td></tr><tr><td>مقص قزحية بون المصغر &nbsp ؛</td><td>ميلتكس &nbsp;</td><td>18-1392</td><td></td></tr><tr><td>محلول الألبومين مصل البقر</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>أ 1595</td><td></td></tr><tr><td>دومون # 3 ملقط &nbsp ؛</td><td>أدوات العلوم الجميلة</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>أنثى الفئران C57BL / 6J</td><td>مختبر جاكسون</td><td>جاكس: 000664</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب gentleMACS C &nbsp ؛</td><td>ميلتيني بيوتيك</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS أوكتو Dissociator&nbsp;</td><td>ميلتيني بيوتيك</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers 30 um&nbsp;</td><td>ميلتيني بيوتيك</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers 70 um&nbsp;</td><td>ميلتيني بيوتيك</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>مايكرو فريدمان بيرسون رونجور</td><td>أدوات العلوم الجميلة</td><td>16220-14</td><td></td></tr><tr><td>المخزن المؤقت لاستخراج النوى&nbsp;</td><td>ميلتيني بيوتيك</td><td>130-128-024</td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 1x بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، PH 7.4 &plusmn ؛ 0.1</td><td>كورنينج</td><td>21-040-السيرة الذاتية</td><td></td></tr><tr><td>مثبط الحمض النووي الريبي الحاقي&nbsp;</td><td>ميليبور سيجما</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي مبرد Sorvall Legend XTR</td><td>ثيرمو ساينتفيك</td><td>50119927-5</td><td></td></tr></tbody></table>

التشريح السريع والتفكك للظهارة الشمية للفأر للمعلقات أحادية النواة

Rapid Dissection and Dissociation of the Mouse Olfactory Epithelium for Single-Nucleus Suspensions

لتوفير سياق تشريحي للتشريح والتحليل ، تم تصور الغرز والعظام في جمجمة الفأر C57BL / 6 ، بالإضافة إلى الجزء المركزي من الظهارة الشمية (OE) ، وترميزها بالألوان (الشكل 1). تم تعليق جانب واحد من كل صورة لتسليط الضوء على الغرز والعظام والتوربينات ذات الصلة ، بينما ترك الجانب الآخر بدون علامة للرجوع إليها. تم إعداد المقطع العرضي للمعدات الأصلية وفقا للبروتوكولاتالمعمول بها 20 ، واستند تحديد التوربينات إلى التوصيفات التشريحية السابقة21.
<p class="j...

The murine olfactory epithelium is the initial entry point of the olfactory system, housing various cell types that include olfactory sensory neurons, ...

rapid-dissection-dissociation-mouse-olfactory-epithelium-for-single

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

التحلل الضوئي للمركبات في قفص يسمح للإنتاج زيادات سريعة ومحلية في مختلف تركيز المركبات النشطة من الناحية الفسيولوجية. هنا ، وتبين لنا كيفية الحصول على التصحيح ، المشبك التسجيلات جنبا إلى جنب مع التحليل الضوئي في مخيم في قفص أو قفص كاليفورنيا لدراسة تنبيغ الشمية في الخلايا العصبية الشمية فصل الماوس الحسية.

فلاش التحلل الضوئي للمركبات محبوس في سيليا من العصبونات الحسية الشمية

يوضح الفيديو عزل الخلايا العصبية الحركية للعين والبوقلة والحركية الشوكية عن جنين الفأر المعدل وراثيا. يعبر الجنين عن الخلايا العصبية الحركية المصنفة ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) لسهولة التصور والتعرف عليها. يتم عزل الخلايا العصبية الحركية جراحيا تحت المجهر الفلوري ويتم الاحتفاظ بها في وسط ثقافة.

عزل وثقافة الخلايا العصبية الحركية للعين والقصير الهوائية والحركية الشوكية من جنين الفأر

يوضح هذا الفيديو طريقة لعزل خلايا الخلايا قليلة التغصن الأولية من تعليق الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها من جرو الفأر باستخدام الفصل المغناطيسي. تستخدم هذه التقنية حبيبات مغناطيسية مغلفة بأجسام مضادة خاصة بمستضدات الخلايا قليلة التغصن ، مما يتيح العزل الانتقائي لهذه الخلايا.

عزل الخلايا قليلة التغصن الأولية في الفئران باستخدام الخرز المناعي المغناطيسي

يوضح هذا الفيديو التسجيل الفيزيولوجي الكهربي للخلايا العصبية الحسية الشمية (OSNs) في الفئران باستخدام تقنية مشبك التصحيح المثقوب. يتم عزل الظهارة الشمية ، التي تحتوي على OSNs مع مستقبلات رائحة تحمل علامات الفلوروفور ، عن الفأر وتثبيتها في غرفة التسجيل. يتم تثبيت ماصة التسجيل على المقبض الشجيري ل OSN، ويقوم النيستاتين داخل الماصة بثقب الغشاء لتكوين اتصال كهربائي بالخلية. أخيرا ، يتم استخدام ماصة أخرى لتوصيل منشط للرائحة ، ويتم تسجيل النشاط الفيزيولوجي الكهربي للخلية المرقعة.

تسجيل مشبك التصحيح المثقوب للخلايا العصبية الحسية الشمية في الفئران

تحتوي فئة  أهداب الخلايا العصبية الحسية الشمية على بروتينات من سلسلة نقل الإشارة ، ولكن من الصعب إجراء تحليل مكاني مفصل لتوزيعها في عمليات التشريح بالتبريد. نصف هنا نهجا محسنا لوضع العلامات على الحامل بالكامل والتصور الوجهي للبروتينات الهدبية.

كله جبل وصفها من سيليا في النظام الشمية الرئيسية من الفئران

لا يزال تحليل الخصائص الفسيولوجية للخلايا العصبية الحسية الشمية يواجه قيودا تقنية. هنا نقوم بتسجيلها من خلال مشبك رقعة مثقب في تحضير سليم للظهارة الشمية في الفئران المستهدفة بالجينات. تسمح هذه التقنية بتوصيف خصائص الغشاء والاستجابات لروابط معينة من الخلايا العصبية التي تعبر عن مستقبلات حاسة الشم المحددة.

مثقب تسجيل التصحيح، المشبك من الماوس العصبونات الحسية الشمية في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها إبداء الرائحة مستقبلات

الخلايا قليلة التغصن هي الخلايا النخاعية للجهاز العصبي المركزي. يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل واستزراع سلائفها ، الخلايا السلفية قليلة التغصن ، من قشرة الفئران ، بالإضافة إلى طريقة كمية سريعة وموثوقة لتقييم تكوين الدبقية قليلة التغصن في المختبر استجابة للعوامل التجريبية.

التحضير للثقافات الجرذ دبقية قليلة التغصن السلف والكمي لOligodendrogenesis عن طريق ثنائي الأشعة تحت الحمراء الضوئي الإسفار

يصف لنا عزلة إيمونوماجنيتيك oligodendrocytes الماوس الأساسي، الذي يسمح لعزل الخلايا في المختبر الثقافة سريعة ومحددة.

عزل إيمونوماجنيتيك سريعة ومحددة من الماوس Oligodendrocytes الأولية

يتم تقديم طريقة للتشريح المجهري لقناة بيض الفأر تسمح بجمع الأجزاء الفردية مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف إجراء تفكك الخلايا البيضوية غير الأنزيمية. الطرق مناسبة لتحليل الجينات والبروتين اللاحق للقطاعات البيضية المختلفة وظيفيا والخلايا البيضوية المنفصلة.

التشريح المجهري وتفكك قناة المبيض المورينية: تحديد الجزء الفردي وعزل الخلية الواحدة

يعتمد نجاح النسخ أحادي الخلية / أحادي النوى ومتعدد الأوميكس إلى حد كبير على جودة الخلايا / النوى. لذلك ، يجب أن يكون عزل الخلايا / النوى عن الأنسجة وتنقيتها موحدا للغاية. يصف هذا البروتوكول تحضير النوى من الدماغ ونخاع العظم لمقايسة النوى المتعددة أحادية النوى في اتجاه مجرى النهر.

تحضير نوى الدماغ ونخاع العظم عالي الجودة لمقايسات النوى المتعددة أحادية النوى

تعلم التشريح السريع للظهارة الشمية في الفئران لتسهيل دراسات تسلسل الحمض النووي أحادي النواة. يتيح هذا البروتوكول البحث في الأساس الجيني للجهاز الشمي بكفاءة عالية.

التشريح السريع والتفكك للظهارة الشمية للفأر للمعلقات أحادية النواة

استكشف المزيد من الفيديوهات