بروتوكول قائم على التألق للفحص الأولي لمثبطات تخليق البروتين من مصادر طبيعية

بروتوكول قائم على التألق للفحص الأولي لمثبطات تخليق البروتين من مصادر طبيعية. يتضمن تخليق البروتينات عمليات منظمة للغاية، ونسخا وترجمة. يتم تنظيم النسخ بشكل أساسي بواسطة عوامل النسخ، وتعديلات الكروماتين، والحمض النووي الريبي التنظيمي.

بينما يتم تنظيم الترجمة بواسطة عوامل البدء ومسارات الإشارة وآليات استقرار الحمض النووي الريبي. تسمح هذه الأنظمة التنظيمية للخلايا بالحفاظ على وظائف الخلايا والاستجابة للضغط أو الضرر بفعالية. خلايا السرطان تخلل في تنظيم تخليق البروتين عن طريق اختطاف الآليات الانتقالية لدعم احتياجاتها العالية من الطاقة ونموها غير المنضبط.

هذه إعادة البرمجة هي نتيجة لاختلال في معظم مسارات الإشارات الرئيسية المسرطة، مما يعزز بقاء الخلية وتكاثرها وانتشارها مع كبح مسارات موت الخلايا. نظرا لأن هذا التخليق المعزز للبروتين ضروري للبقاء على قيد الحياة على السرطان، فإن العلاجات التي تستهدف وتمنع هذه العملية تظهر وعودا كعلاجات محتملة. لتحديد مثبطات تخليق البروتين، يمكن استخدام اختبار فلورة تثبيط تخليق البروتين التالي.

قبل بدء التجربة، وللحصول على نتائج موثوقة، يجب إعطاء المركبات بتركيز مناسب أقل من عتبة السمية. لتحديد تركيز البداية، يجب إجراء اختبار السمية الخلوية لتحديد EC 50 للمركب. إذا لم يكن ذلك ممكنا، يمكن اختبار المركبات في هذا الاختبار بطريقة تعتمد على الجرعة لتحديد أكثر معايير التركيز فعالية.

إذا تسبب تركيز المركبات في موت الخلية، يصبح من الضروري إجراء اختبارات بتركيزات منخفضة. من المهم أيضا حماية الأصباغ من الضوء في جميع الأوقات عندما لا تكون قيد الاستخدام. التعرض الممتد للضوء سيؤدي إلى تبييض ضوئي، مما يؤدي إلى تدهور جودة البيانات.

الخطوة 3.1، جهز الخليط الرئيسي A، وسم أنبوب الطرد المركزي ك A ثم الماصة 598.5 ميكرولتر من وسط الزراعة، و1.5 ميكرولتر من ملصق البروتين في A. أعد تعليق هذا الخليط لضمان التجانس عن طريق التوصيل بالماصات لأعلى وأسفل. الآن حضر الخليط الرئيسي B. قم بوضع علامة على أنبوب طرد مركزي ك B، ثم استخدم الماصة بحجم 1.5 ميكرولتر من ملصق البروتين، و6.6 ميكرولتر من السيكلوهكسيمايد و591.9 ميكرولتر من وسط الزراعة في B. أعد تعليق هذا الخليط لضمان التجانس عن طريق التوصيل بأنبوب الأنابيب للأعلى والأسفل. بعد صب ميكرولتر واحد من مركب الاختبار وميكرولتر واحد من المركبة في بئرين، قم بعمل 99 ميكرولتر من خليط ماستر A بلطف في كلا هذين البئرين، ثم وضع الماصة بزاوية في جانب البئر لمنع الاضطراب الحركي للخلايا.

خليط بيبيت 100 ميكرولتر من ماستر ب في بئرين غير معالجين. مقطعية بزاوية داخل جانب البئر لمنع الاضطراب الحركي للخلايا. انقر بلطف على اللوح لتحقيق دمج كامل للمكونات المطلوبة داخل الخلايا.

حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعتين. إزالة وسط زراعة الخلايا عن طريق الشفط. قم بإمالة اللوح واستنشق السحب من جانب البئر بدلا من المركز لمنع الاضطراب الحركي للخلايا.

ثم أضف 100 ميكرولتر من مخزن PBS في كل بئر وقم بطرد مركزي على اللوح عند 900 جرام لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي، تذكر إزالة مخزن PBS عن طريق الشفط. الخطوة الخامسة، التثبيت والنفاذية.

أضف 100 ميكرولتر من محلول التثبيت إلى كل بئر. ثم حضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في بيئة مظلمة. ثم استنشق الخلايا.

اغسل الخلايا ب 100 ميكرولتر من محلول الغسيل وأزيلها عن طريق الشفط. كرر هذا مرتين. أضف 100 ميكرولتر من مخزن نفاذية إلى كل بئر.

بعد ذلك، قم بالحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أزل مخزن النفاذية عن طريق الشفط. الخطوة السادسة، تفاعل البروتين والتلوين.

حضر خليط الكوكتيل الرئيسي للتفاعل. أضف 651 ميكرولتر من مخزن PBS إلى أنبوب الطرد المركزي. ثم أضف سبعة ميكرولترات من مادة الكواشف النحاسية 100x.

ثم سبعة ميكرولترات من الأزيد الفلوري. وأخيرا، أضف 35 ميكرولتر من عامل الاختزال إلى أنبوب الطرد المركزي. اتبع هذا الترتيب بالضبط عند إضافة الكواشف، ثم أضف 100 ميكرولتر من كوكتيل التفاعل إلى كل بئر.

حضن الخلايا لمدة 30 دقيقة في بيئة مظلمة ودرجة حرارة الغرفة لمنع التبييض الضوئي. قم بعمل الطرد المركزي على الخلايا عند 900 جرام لمدة خمس دقائق. استنشق النفس، اغسل الخلايا، ثم استنشق مرة أخرى.

جهز كمية مخففة 1x من صبغة الحمض النووي الكلي وأضف 100 ميكرولتر لكل بئر. حضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في بيئة مظلمة لمنع التبييض الضوئي. قم بعمل طرد مركزي على الطبق عند 900 جرام لمدة خمس دقائق.

اغسل الخلايا بسعة 100 ميكرولتر من محلول الغسيل، وأزيلها عن طريق الشفط. كرر هذه الخطوة مرتين. وأخيرا، أعد تعليق الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من محلول PBS المبرد لتحضيرها للتصوير.

الخطوة الثامنة، التصوير. أدخل اللوحة في قارئ اللوحة واضبط التكبير على 20 مرة. حلل صبغة النواة باستخدام قناة GFP 469/525 نانومتر.

استخدم الانحناء التلقائي والتركيز التلقائي لتحسين نتائج التصوير. تحليل تخليق البروتين النشط باستخدام قناة Texas Red 586/647 نانومتر. استخدم الانحناء التلقائي والتركيز التلقائي لتحسين نتائج التصوير.

المجسات الفلورية حساسة للتبييض الضوئي، وهو ظاهرة يتسبب فيها الإشعاع مع الضوء في فقدان الفلوروفورات لخصائصها الفلورية. يجب حماية الأصباغ من الضوء في جميع الأوقات عند عدم الاستخدام. بالإضافة إلى ذلك، يجب تحديد عدد المسح داخل كل بئر والوقت تحت الضوء المشع.

التعرض الممتد للضوء سيؤدي إلى تبييض ضوئي، مما يؤدي في النهاية إلى تدهور جودة البيانات. دعونا ننظر إلى النتائج التمثيلية. تظهر خلايا حية هنا باللون الأخضر، ويتم الإشارة إلى تخليق البروتين النشط باللون الأحمر.

يؤدي العامل المعروف لمثبط تخليق البروتين إلى انخفاض كبير في تخليق البروتين كما هو موضح في الشكل 1B مقارنة ب DMSO السلبي في الشكل 1A، حيث ينبعث ضوء فلوري أحمر أقل. أدى العلاج بالمركب الأول كما هو موضح في الشكل 1C إلى انفصال الخلية أو موت الخلية. لذا، لا يمكننا تقديم أي ادعاءات قاطعة حول نشاطه في تثبيط تخليق البروتينات.

وهذا يستدعي دراسات إضافية لاستجابة الجرعة لمحاولة تحديد ما إذا كان يعيق تخليق البروتين عند تركيزات أقل. المركب الثاني يظهر تثبيط تخليق البروتين بشكل معتدل كما هو موضح في الشكل 1D. يعد هذا الاختبار الفلورومتري أداة بحثية قيمة وطريقة سهلة الوصول في علم الأحياء الكيميائي لتدريب طلاب المرحلة الجامعية.

من خلال توفير بروتوكول سهل الوصول وفعال مع معالجة بيانات قليلة، يوفر للطلاب خبرة عملية وتقنيات اكتشاف الأدوية الحديثة ويسرع عملية اكتشاف الأدوية. يستخدم البروتوكول ركيزة فلورية وتقنيات مجهر فلورية متقدمة للكشف المنهجي وقياس القدرات المثبطة لمركبات المنتج الطبيعي واحد والثاني بشكل منهجي. باستخدام السيكلوهكسيميد كمثبط مرجعي، أظهر كلا المنتجين الطبيعيين مستويات متفاوتة من تثبيط تخليق البروتين.

مع تزايد الطلب على مثبطات تخليق البروتينات الجديدة، يزود هذا النهج طلاب البكالوريوس بفرص بحثية ذات معنى مع المساهمة في التقدم في علاجات السرطان.