نموذج Ex Vivo Explant لدراسة التفاعلات الدبقية في شبكية العين الفأر

نريد أن نفهم الالتهاب العصبي في الجلوكوما ، السبب الرئيسي للعمى الذي لا رجعة فيه في جميع أنحاء العالم. على وجه التحديد ، نحن ندرس كيفية تأثير الخلايا الدبقية الداعمة في شبكية العين على فقدان الخلايا العصبية أثناء تطور المرض.

يعتقد أن الخلايا الدبقية مثل الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة تؤثر على تطور الجلوكوما ، ولكن العديد من الأدوات المستخدمة لدراسة وظيفة الخلايا العصبية في نماذج الحية غير مناسبة لهذه الخلايا. تستخدم مستخلصات الشبكية لدراسة الالتهاب العصبي ووظيفة الدبق ، لكن منحنى التعلم حاد. يجعله بروتوكولنا أكثر سهولة ونأمل أن يتيح التبني الأوسع للتقنية.

بالمقارنة مع زراعة الخلايا التقليدية في المختبر ، فإن نهج الزرع الخاص بنا يحافظ بشكل أفضل على البيئة الطبيعية للخلايا في شبكية العين الداخلية ، مما يتيح إجراء تحقيق أكثر دقة في وظائفها الفسيولوجية.

[الراوي] للبدء ، ضع عين الفأر المستخرجة في طبق تشريح مليء ب PBS معقم بدرجة حرارة الغرفة. حدد نقطة التثبيت المناسبة وامسكها بالملقط بزاوية ، ثم ضع العين برفق على منديل المختبر المغمور مع التأكد من وضع المحور الأمامي الخلفي من القرنية إلى العصب البصري أفقيا. مع الحفاظ على ثبات قوي باستخدام ملقط بزاوية ، استخدم طرف مشرط رقم 11 لعمل شق مواز وحوالي 0.5 ملم خلف الأطراف حيث تنتقل القرنية إلى الصلبة. أدخل شفرة واحدة من مقص الزنبرك داخل الكرة الأرضية واقطعها بشكل دائري حول العين ، وأعد وضعها حسب الحاجة باستخدام الملقط. بعد الانتهاء من القطع المحيطي ، قم بإزالة الجزء الأمامي والعدسة باستخدام الملقط. إذا بقيت قطعة طويلة من العصب البصري ، فقم بقصها بطول من ملليمتر إلى ملليمترين باستخدام مقص ناعم. ثم قم بتدوير كوب العين بحيث يكون متجها لأعلى لتمكين الفحص البصري وتسهيل إزالة الجسم الزجاجي. استمر في استخدام ملقط بزاوية لتثبيت كوب العين وفحص شبكية العين بحثا عن تلف مرئي وفحص الحجرة الزجاجية بحثا عن بقايا الخلايا المصطبغة من ظهارة صبغة الشبكية أو المشيمية. باستخدام ماصة نقل معدلة، اغسل الغرفة الزجاجية باستخدام PBS، مع الحفاظ على طرف الماصة مغمورا لمنع فقاعات الهواء. بعد ذلك ، باستخدام فرشاة ألوان مائية دقيقة ، قم بإزالة الحطام الأكبر برفق مع تقليل ملامسة شبكية العين. بالنسبة للحطام المستمر، استخدم ملقطا رفيع الرؤوس بعناية، وتجنب ملامسة المعدن المباشرة لشبكية العين. بعد إزالة الحطام المرئي ، اغسل الغرفة الزجاجية باستخدام PBS من ماصة النقل ثلاث إلى خمس مرات واستخدم الفرشاة الدقيقة للفحص بالقرب من المحيط بحثا عن عناصر الجسم الهدبي المتبقية ، والكشف عن الجسم الزجاجي عن طريق السحب على ألياف الفرشاة. إذا بقيت جيوب من الجسم الزجاجي ، فقم بتمريرها للخارج باتجاه المحيط بالفرشاة ، مع الحفاظ على الألياف متأخرة بزاوية ضحلة لمنع تلف الشبكية. امسك زوجا من الملقط في وضع مغلق مع لمس الأطراف وأدخلها برفق بين شبكية العين والمشيمية باستخدام أي فجوات طبيعية تشكلت أثناء المناولة. استخدم الأذرع المسطحة للملقط لتوسيع المسافة بين شبكية العين والمشيمية تدريجيا حتى يتم تحقيق الفصل الكامل. استمر في تثبيت العينة باستخدام زوج واحد من الملقط أثناء استخدام زوج ثان لسحب كوب العين برفق ، بما في ذلك الصلبة والمشيمية ، لأسفل. إذا نزلت شبكية العين مع كوب العين ، فاستخدم الملقط للفحص برفق وفصل أي نقاط اتصال متبقية ، وتجنب رأس العصب البصري. ثم مع استمرار تثبيت شبكية العين في رأس العصب البصري ، استمر في تثبيت الأنسجة واستخدم الزوج الثاني من الملقط لتجميع كوب العين أسفل رأس العصب البصري. افحص للتأكد من أن محيط الشبكية غير مطوي بسبب الجسم الزجاجي المتبقي ، خاصة في المواقع التي يبقى فيها الجسم الهدبي. إذا لزم الأمر، اغسل الغرفة باستخدام PBS باستخدام ماصة نقل واستخدم الفرشاة لفك أي شبكية مطوية برفق وإزالة الجسم الزجاجي الزائد. بعد تعرض شبكية العين من كلا الجانبين ، استخدم المقص الزنبركي لعمل سلسلة من الجروح المخففة بزاوية 90 درجة تقريبا من محيط الشبكية باتجاه رأس العصب البصري. أثناء الإمساك بالأنسجة المغمورة ، استخدم الملقط لسحب منديل المختبر بشكل جانبي بعيدا عن العينة وإزالته من الطبق دون لمس شبكية العين. أثناء تثبيت شبكية العين في مكانها ، استخدم المقص الزنبركي لقطع العصب البصري أسفل شبكية العين مباشرة. ثم ارفع بعناية وقم بإزالة أنسجة كوب العين المتبقية من الطبق. الآن املأ طبق بتري مقاس 35 ملم ب PBS واستخدم الملقط لوضع مربع مرشح في الأسفل بحيث يكون الجانب الخشن غير اللامع متجها لأعلى ، وتجنب أي تجاعيد. بعد ذلك ، باستخدام ماصة النقل ، قم بشفط شبكية العين برفق ونقلها إلى طبق بتري. استخدم الفرشاة لتوجيه شبكية العين بحيث يكون السطح الداخلي متجها لأعلى وضعه مباشرة فوق مربع المرشح. قم بشفط PBS ببطء لخفض شبكية العين على الفلتر. بمجرد وضع شبكية العين على الفلتر ، استخدم الفرشاة لفتح أي طيات طرفية برفق. اضبط مستوى PBS لتحقيق التوازن بين استقرار الشبكية والترطيب ، مما يسمح بحركة الفرشاة بسلاسة دون تجفيف الأنسجة. استخدم الآن ماصة النقل لتقطير PBS من حوالي سنتيمتر واحد أعلاه لشطف السطح وفحص شبكية العين مرة أخرى بحثا عن الحطام. أغلق غطاء الطبق مقاس 35 ملم واحمله إلى خزانة السلامة الحيوية. ضع الطبق المغلق داخل خزانة السلامة الحيوية دون ملامسة أي أسطح أو معدات داخلية. قم بتعقيم القفازات أو استبدالها عند الانتقال إلى العمل المعقم ونقل اللوحة المكونة من ستة آبار المحملة مسبقا بوسائط الزرع من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية. داخل الخزانة ، قم بإزالة غطاء الطبق مقاس 35 ملم واستخدم ملقطا بزاوية لرفع مربع المرشح دون لمس شبكية العين. ثم افتح اللوحة المكونة من ستة آبار وقم بخفض الفلتر برفق في وسط الملحق في بئر واحد ، واغمره ببطء في الوسائط. بمجرد فصل شبكية العين عن الفلتر ، حرك الفلتر جانبا ببطء وقم بإزالته من البئر باستخدام ملقط بزاوية. استخدم ماصة سعة مليلتر واحد لشفط 500 ميكرولتر من الوسائط من الملحق ، مما يؤدي إلى حبس شبكية العين بين الملحق وواجهة الهواء السائل. أخيرا ، استبدل الغطاء الموجود على اللوحة المكونة من ستة آبار وأعده إلى الحاضنة ، مع التأكد من بقاء شبكية العين متمركزة داخل البئر. لفحص التغيرات واسعة النطاق في الخلايا الدبقية في الشبكية ، تمت مقارنة شبكية العين المزروعة لمدة ثلاثة أيام مع النباتات الزائفة التي تم إصلاحها مباشرة بعد العزل بدلا من زراعتها. أظهرت الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين الزائفة نمط توزيع منتظم وغير متداخل ، بينما بحلول اليوم الثالث ، أصبح تنظيم شبكية العين غير منتظم مع ظهور الخلايا العنقودية ، مما يعني الهجرة. أظهرت الخلايا النجمية في شبكية العين الزائفة محاذاة وثيقة مع الأوعية الدموية ، والتي تضاءلت بشكل كبير بعد ثلاثة أيام في المختبر. كان تعبير GFAP في خلايا مولر باهتا أو غائبا في شبكية العين الزائفة ولكنه أصبح مرئيا بوضوح بحلول اليوم الثالث في المختبر ، خاصة بالقرب من حواف الأنسجة. بعد يوم واحد في المختبر ، أظهرت الخلايا الدبقية الصغيرة تراجعا في العملية وعلامات مبكرة للتنشيط والتي تطورت إلى مورفولوجيا أميبيويد مدمجة بحلول اليوم الثالث. عند علامة 24 ساعة ، أظهرت كثافة الخلايا العقدية الشبكية التي تم تحديدها كميا باستخدام Brn3a انخفاضا متواضعا ولكنه ملحوظ في المستنخاسات المستخرجة على المستنخاسات الزائفة. تم التعبير عن TMEM119 ، وهي علامة دبقية صغيرة متجانسة ، بشكل كبير في شبكية العين الزائفة ولكن كان من غير الممكن اكتشافها تقريبا بعد ثلاثة أيام في المختبر. ظل تعبير CD206 ، الذي يشير إلى خلايا الهيالويات ، مستقرا بعد ثلاثة أيام من الزراعة في المختبر. كشف تلطيخ GFAP عن تفاعل الخلايا النجمية وخلايا مولر حول مواقع الإصابة الميكانيكية التي لحقت بها أثناء التشريح والتعامل.