ووضع العلامات hESCs hMSCs مع أوكسيد الحديد النانوية لعدم الغازية في تعقب المجراة مع التصوير بالرنين المغناطيسي

لتقييم علاجات جديدة من الخلايا الجذعية من المهم جراحية غير المسار حقن الخلايا في الجسم الحي. هذا الفيديو سوف تظهر لك كيفية تسمية الخلايا الجذعية البشرية الجنينية والوسيطة مع وكلاء النقيض من أكسيد الحديد الموجودة في الجسم الحي عن التصوير بالرنين المغناطيسي لاحق في الجسم الحي.

مرحبا بكم في مختبر الدكتور هايكو دال لينك. نود أن نشكر معهد كاليفورنيا للطب التجديدي على تمويل هذا المشروع لتقييم علاجات الخلايا الجذعية الجديدة. من المهم تتبع الخلايا المحقونة بشكل غير جراحي في الجسم الحي.

هذا ممكن عن طريق تسمية الخلايا في المختبر بعوامل تباين محددة أو متعددة الوظائف للتصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير البصري. سيوضح لك هذا الفيديو كيفية تسمية الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية والخلايا الجذعية الجنينية البشرية للتصوير اللاحق في الجسم الحي. مرحبا ، أنا توبياس هينينج من مجموعة أبحاث عامل التباين في مركز التصوير الجزيئي والوظيفي في قسم الأشعة بجامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو.

سأريكم اليوم إجراءات وضع العلامات في المختبر على الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية مع بيريك ، كارون ، والخلايا الجذعية الجنينية البشرية بأكاسيد الفيم. هذه التقنية مفيدة من أجل توطين الخلايا المحقونة في الجسم الحي أو للحصول على معلومات حول حالتها الوظيفية. تختلف إجراءات وضع العلامات على الخلايا باستخدام عامل واعي للتصوير بالرنين المغناطيسي بالنسبة للخلايا الجذعية الجنينية والوسيطة ، ولكن كلتا الطريقتين تتضمنان الخطوات التالية ، إعداد مزرعة الخلية التي يتم طلاء الخلايا على أنها تلتصق بمزارع الخلايا ، وإعداد الملصقات ، ووضع العلامات على الوسائط للخلايا عن طريق حضانة بسيطة ، واختبار التربسين للخلايا الجذعية ، وغسل تقييم العامل الواعي الحر لكفاءة وضع العلامات وصلاحية الخلية.

لذلك دعونا نبدأ ونسمية بعض الخلايا. لنبدأ الآن بتسمية الخلايا الجذعية الوسيطة باستخدام ثيو كارباترول. أولا ، سأعرض تقنية وضع العلامات على الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية باستخدام ثيو كارون وعامل تباين قائم على أكسيد الحديد للتصوير بالرنين المغناطيسي.

للبدء ، نقوم بطلاء الخلايا قبل 18 إلى 24 ساعة من إجراء وضع العلامات في قوارير T 75 عند التقاء 80٪ خلاف ذلك ، إذا كنت تستخدم طبقا مختلفا للثقافة يساوي حوالي 10،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في اليوم التالي ، فإننا نبدأ بإعداد وسائط الملصقات بإضافة 30 ميكرولترا من الاحتياط إلى ثمانية ملليلتر من الوسائط الخالية من المصل. سيؤدي هذا إلى تسمية T 75 FLA واحد بطلاقة مشتركة تبلغ 80٪ ويتوافق مع تركيز مائة ميكروغرام من الحديد لكل مليلتر من الوسائط. الآن نقوم بخلع وسائط الاستزراع وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS أو وسائط خالية من المصل.

نقوم بذلك للتخلص من بروتينات المصل المتبقية والمكونات الأخرى للوسائط التي يمكن أن تربط عوامل التباين وتؤثر على كفاءة وضع العلامات. أضف وسائط الملصقات إلى القارورة وأعد القارورة إلى الحاضنة. بعد ساعتين ، أضف ملين من FCS حتى يتم تحقيق تركيز نهائي بنسبة 20٪ من FCS.

نقوم بذلك للتأكد من أن الخلايا لا تتلقى أي حافز للتمييز بين أنها ميتة تنمو في بيئتها المألوفة. الآن نحتضن الخلايا لمدة 18 ساعة. في اليوم التالي نقوم بشطف الخلايا باستخدام PBS ثم نقوم بتثبيتها وفقا لبروتوكولات الثقافة المعيارية للتخلص من عامل التباين الحر.

بمجرد إدخال Tryps ، يتم غسل تعليق الخلية ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي عند 400 RCF لمدة خمس دقائق ، وتعليق reus في PBS. هذا هو. يمكن إعادة تعليق الخلية النهائية P وهي جاهزة لمزيد من التجارب.

نحسب الخلايا الآن لأننا ربما فقدنا بعضها أثناء خطوات الغسيل السابقة. نقوم أيضا بإجراء اختبار الجدوى في هذه المرحلة باستخدام مقايسة الاستبعاد الأزرق التربيبي ونأخذ بعض العينات للتحليل الطيفي لقياس كفاءة وضع العلامات. الآن اسمحوا لي أن أوضح لكم كيفية تسمية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية بأكاسيد الفيم.

للبدء ، نقوم بوضع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في أطباق 10 سم. كالعادة ، يتم ترميز هذه الأطباق مسبقا بالجيلاتين وتحتوي على خلايا مغذية مشععة عليها. يمكنك استخدام هذا البروتوكول للثقافات المجانية للمغذيات أيضا.

تركنا الخلايا الجذعية الجنينية البشرية تلتصق وتنمو لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام تقريبا بحيث تشكل مستعمرات متوسطة الحجم. خلال هذا الوقت ، نضمن أن المستعمرات لا تنمو بشكل كبير لأن المستعمرات الكبيرة يصعب تفكيكها. في وقت لاحق ، يمكن للخلايا المتمايزة أن تلوث هذه الثقافات.

لذلك اعتمادا على نظافة المستعمرات ، قد نضطر إلى التخلص من الثقافات المتمايزة عن طريق التشريح. الآن نقوم بإعداد وسائط الملصقات التي تتكون من أكاسيد نظرية بتركيز مائة ميكروغرام من الحديد لكل مليلتر ووسائط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الكاملة. لهذا ، نخلط 89 ميكرولتر وأكاسيد phem و 10 مل من وسائط النمو الكاملة.

أما بالنسبة للخلايا الجذعية الوسيطة ، فنقوم بغسل الطبق مرة واحدة بوسائط كاملة للتخلص من الخلايا الميتة أو الحطام. ثم نضيف 10 ملليلتر من وسائط الملصقات لكل طبق ونحتضن الخلايا لمدة أربع ساعات. الآن اكتملت وضع العلامات.

في الخطوة التالية ، نحتاج إلى غسل الخلايا والحصول على معلق خلية واحدة. لمزيد من الاستخدام لهذا ، نقوم أولا بشطف الطبق باستخدام PBS. نستبدل الآن PBS بخمسة ملليلتر من 0.25٪ تريبسين ونحتضن لمدة خمس دقائق في الحاضنة أو حتى تنفصل الخلايا.

من المفيد النقر على الطبق بشكل متكرر ، حيث انفصلت الخلايا الآن. ضع في اعتبارك أنه إذا كان الطبق يحتوي على مستعمرات أكبر ، فقد تكون بعض الكتل المتبقية للتخلص من هذه الكتل. نقوم بخلط التعليق بالكامل جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، باستخدام ماصة مصلية ، ثم نتركه لمدة دقيقتين أخريين.

في التربسين. نحن لا نستخدم ماصة eppendorf لأن الماصة المتكررة للخلايا من خلال الطرف الرفيع يمكن أن تكسر أغشية الخلايا إذا كان كل شيء يعمل بشكل صحيح. لدينا معلق خلية واحدة الآن ممزوج بالكثير من الحطام الناجم عن الجيلاتين ، وطلاء مصفوفة الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الميتة.

يمكننا الآن التخلص من الكتل أو المجمعات المتبقية عن طريق تمرير الخلايا عبر مصفاة خلوية 40 ميكرومتر. الآن نحن بحاجة إلى عزل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من الخلايا المغذية المشععة. يمكن القيام بذلك بكفاءة عن طريق طلاء تعليق الخلية على طبق مطلي بالجيلاتين.

إذا لم نتلاعب بالطبق ، فسوف تترسب جميع الخلايا ، لكن المغذيات سوف ترتصق بشكل أسرع من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. لذلك إذا خلعنا SUP natin بعد 45 دقيقة ، فيجب أن يحتوي بشكل أساسي على خلايا جذعية جنينية بشرية ، بينما يجب إرفاق المغذيات بشكل أساسي بالطبق. بهذه الطريقة ، نحصل على معلق خلية واحدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المسماة مغناطيسيا والتي يمكن استخدامها لمزيد من التجارب كما في البروتوكول السابق.

في هذه المرحلة ، تحتاج إلى عد الخلايا وأخذ عينات لتقييم الجدوى وقياس كفاءة وضع العلامات. هذا ينهي البروتوكولات التي أردت أن أريكم اليوم. الآن دعونا نلقي نظرة على كيفية تتبع الخلايا الجذعية المصنفة في الجسم الحي.

تظهر هذه الشريحة الخلايا الجذعية المسماة OC Carone. بعد حقنها في دماغ الفأر ، قمنا بتعليق 20،000 خلية بحجم 75 نانولتر وحقنها في المنطقة تحت البطين. يتسبب أكسيد الحديد في الخلايا المزروعة في حدوث قطعة أثرية للحساسية يمكن رؤيتها في التصوير بالرنين المغناطيسي. الصور.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية تسمية الخلايا الجذعية الجنينية والوسيطة. في المختبر مع عوامل Mr.Contrast التي تتعقب الخلايا الجذعية الوسيطة والجنينية في الجسم الحي لديها إمكانات هائلة لتقييم علاجات الخلايا الجذعية الجديدة. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في وضع العلامات على الخلية الخاصة بك.