القياس الكمي للفيولاسين في Chromobacterium violaceum وتثبيطه بالمركبات النشطة بيولوجيا

يهدف بحثنا إلى تحديد المركبات التي تمنع استشعار النصاب ، والذي ينظم الأنماط الظاهرية الرئيسية. يقوم هذا البروتوكول بفحص الجزيئات التي تقلل من إنتاج الفيروسين دون التأثير على نمو البكتيريا ، مما يشير إلى تداخل استشعار النصاب القانوني. حددت الدراسات الحديثة مركبات نشطة بيولوجيا جديدة تمنع استشعار النصاب دون التأثير على نمو البكتيريا ، مما يعزز إمكاناتها كعوامل مضادة للضراوة ضد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية.

تشمل التحديات الرئيسية خصوصية تثبيط استشعار النصاب ، لأن المركبات قد تؤثر على النمو أو السمات. في هذا البروتوكول المسمى الإذعان والذوبان ، يتطلب القياس الكمي لموازنة تأثير الذوبان معالجة دقيقة. أنشأنا بروتوكولا يستخدم في المركبات النشطة بيولوجيا بتركيزات شبه مثبطة لا تؤثر على نمو البكتيريا.

هذه فرضية رئيسية لبدء إشارات استشعار النصاب المختلفة عن أبحاث مضادات الميكروبات. سنركز على تحديد مثبطات حالة النصاب الجديدة وآليات تثبيط التواصل الموضحة ، خاصة في البكتيريا ذات الصلة بالغذاء والصحة. للبدء ، قم بزراعة مزرعة خمسة ملليلتر من chromobacterium violaceum ATCC 12472 في مرق Luria Bertani أو LB.

احتضن المزرعة عند 30 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز مضبوطة على 220 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. قم بقياس الكثافة البصرية للثقافة الليلية واضبطها إلى ما يقرب من واحد في 10 لقوة ثماني وحدات تشكيل مستعمرة لكل مليلتر. باستخدام مرق LB.

لتحضير المركب ، قم بوزن المركب النشط بيولوجيا وتخفيفه إما في DMSO نقي أو خليط واحد إلى واحد من DMSO والماء اعتمادا على الذوبان. خذ صفيحة 96 بئر مسطحة القاع وأضف مرق LB مع المركب النشط بيولوجيا وفقا لمخطط التخفيف التسلسلي. لحساب الحجم المطلوب من محلول المخزون للتركيز المطلوب في كل بئر ، قم بتطبيق الصيغة.

في العمود الأول من كل مجموعة تخفيف الحبوب. أضف 196 ميكرولتر من مرق لوريا بيرتاني إلى الأعمدة الثالثة والخمسة والسبعة. ثم في الأعمدة اللاحقة المستخدمة للتخفيف ، أضف 100 ميكرولتر من مرق لوريا بيرتاني إلى الأعمدة الرابعة والستة والثامنة.

لبدء التخفيف التسلسلي ، أضف أربعة ميكرولتر من المركب النشط بيولوجيا إلى البئر الأول من كل مجموعة ، وهو ما يتوافق مع الأعمدة الثالثة والخمسة والسبعة. بعد الخلط ، انقل 100 ميكرولتر من كل بئر إلى العمود المجاور. لمواصلة التخفيف التسلسلي للوصول إلى الأعمدة الرابعة والسادسة والثامنة.

كرر الإجراء بأكمله ثلاث مرات لكل تركيز من كل مركب باستخدام نصائح جديدة لتجنب التلوث المتبادل. أضف 80 ميكرولتر من مرق لوريا بيرتاني إلى الصفوف من ب إلى د في جميع الآبار. ليصل الإجمالي إلى 180 ميكرولتر لكل بئر.

ثم أضف 20 ميكرولتر من ثقافة الكروموباكتيريوم القياسية من المستحضر السابق إلى كل من تلك الآبار ، لتصل إلى الحجم النهائي البالغ 200 ميكرولتر. بناء على توافق مقياس الطيف الضوئي. قم بتغطية الصفيحة الدقيقة بغطاء أو فيلم مانع للتسرب لمنع التبخر.

احتضان الطبق المغلق عند 30 درجة مئوية مع التقليب بمعدل 130 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، انقل اللوحة إلى حاضنة تجفيف على درجة حرارة 60 درجة مئوية. قم بإزالة الغطاء واتركه حتى يجف تماما لمدة ثماني ساعات تقريبا.

بمجرد أن يجف ، قم بإزالة الطبق من الحاضنة وأضف 200 ميكرولتر من DMSO النقي إلى كل بئر. غطي الطبق واحتضنه على حرارة 25 درجة مئوية مع الرج بمعدل 130 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة لإذابة صبغة الفيولسين. بعد الحضانة ، انقل بعناية 100 ميكرولتر من محلول الفيولسين المذاب إلى صفيحة دقيقة جديدة.

تجنب ملامسة طرف الماصة وجدران البئر. قم بقياس امتصاص الفيولسين عند 595 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي ذو الصفيحة الدقيقة مع الغطاء لتجنب التلوث. رج العبوة لمدة خمس ثوان قبل كل قراءة وقم بإجراء القراءة مع الغطاء لتجنب التلوث.

لحساب إنتاج النقض ، اطرح أولا امتصاص الفراغ من كل عينة لاستبعاد تداخل الخلفية ، ثم احسب النسبة المئوية للفيولسين باستخدام عنصر التحكم غير المعالج كمرجع للمعادلة. تم اختبار ثلاثة مركبات نشطة بيولوجيا ، ريسفيراترول ، فارنيسول ، ولينالول لقدرتها على تثبيط إنتاج الفيولاسين في كروموباكتيريوم فيولاسيوم ATCC 12472. قلل فارنيسول بشكل كبير من إنتاج الفيولسين إلى 9٪ عند 200 ميكروغرام لكل مليلتر وإلى 19٪ عند 100 ميكروغرام لكل مليلتر ، مقارنة ب 100٪ في عنصر التحكم غير المعالج.

أدى العلاج باللينالول بكل من 200 و 100 ميكروغرام لكل مليلتر إلى إنتاج فيولسين بنسبة 32٪ مما يدل على تثبيط 68٪ مقارنة بالسيطرة. ريسفيراترول بمعدل 25 ميكروغرام لكل مليلتر ، قلل من إنتاج الفيولسين إلى 15٪ بينما عند 12 ميكروغراما لكل مليلتر ، وصل إلى 30٪ مقارنة ب 100٪ في العنصر الضابط غير المعالج. أكدت صور الألواح الدقيقة بصريا انخفاض تصبغ الفيولسين لجميع العلاجات مقارنة بالتحكم غير المعالج.