في المختبر إعادة تكوين شبكات الهيكل الخلوي داخل الحويصلات العملاقة أحادية الصفيحة المنفصلة عن الطور (GUVs)

يستكشف بحثنا ما إذا كانت الخلية الاصطناعية البسيطة يمكنها تكرار الوظائف البيولوجية الرئيسية ، مع التركيز على تصميم الأغشية التي تحاكي عن كثب بنية وسلوك الأغشية الخلوية الطبيعية.

يتم استخدام تقنيات مختلفة لصنع حويصلات مفصولة عن الطور واستخدام هذه الناقلات الدقيقة لمجموعة متنوعة من التطبيقات. التقنيات ، على سبيل المثال ، هي طبقة مزدوجة cDICE والتشكيل الكهربائي. يتمثل أحد التحديات الرئيسية في الحفاظ على وظائف البروتين مع توليد فصل الطور على حويصلة الغشاء. يمكن أن تؤدي زيادة درجة الحرارة إلى زعزعة استقرار البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى.

[الراوي] للبدء ، احصل على قوارير من خلطات الدهون البيوتينيلية وغير البيوتينية. قم بإذابة 50 ميكرولترا من كل مزيج دهني 32 مليمولار في الكلوروفورم. ثم جففها في قارورتين زجاجيتين تحت تدفق غاز النيتروجين لمدة 15 دقيقة تقريبا. ضع القوارير الزجاجية في مجفف. قم بتخزينها تحت الفراغ لمدة 30 دقيقة تقريبا لإزالة أي كلوروفورم متبقي. الآن ، قم بتفريق الأغشية الدهنية المجففة في خليط من 20 ميكرولتر من الديكان و 500 ميكرولتر من الزيت المعدني في نفس القوارير لتحقيق تركيز دهني نهائي يبلغ 3.2 ملليمولار. باستخدام سونيكاتير الحمام ، قم بصوتنة الخليطين عند حوالي 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم انقل مخاليط الدهون والزيت إلى أنبوبين. أثناء احتضان الخلائط ، قم بإعداد مزيج التغليف الداخلي للبروتينات. لتحضير خليط البروتين FtsZ ، أضف الكواشف المدرجة إلى الحجم النهائي البالغ 10 ميكرولتر في أنبوب. احفظ الخليط على الثلج حتى الاستخدام. لتغليف حزم الأكتين ، قم أولا بإعداد 10 ميكرولتر من مزيج الأكتين الرئيسي ، الذي يحتوي على 86٪ G-actin ، و 10٪ ATTO 488 أكتين ، و 4٪ أكتين بيوتينيل في الماء. احتفظي بالمزيج على الثلج وحمايته من الضوء. قبل الاستخدام مباشرة ، قم بإعداد محلول الأكتين النهائي عن طريق إضافة ، بالترتيب ، iodixanol ، والماء ، و NeutrAvidin ، و BSA ، و Ficoll 70 ، و 10x buffer لبلمرة الأكتين ، و A-Mix ، و fascin ، و ATP. تخلط جيدا وتستخدم خمسة ميكرولترات للتغليف. لتغليف FtsZ، ضع الماصة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل FtsZ في أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 ملليلتر. أضف برفق 200 ميكرولتر من مزيج الدهون والزيت لتشكيل واجهة زيت وماء. في أنبوب ثان ، أضف 200 ميكرولتر من مزيج الدهون والزيت. احتضان هذا الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتقطيع خمسة ميكرولترات من مزيج بروتين FtsZ إلى أنبوب الدهون والزيت المحتضن ، مما يسمح له بالغرق كقطرة. اضغط برفق على الأنبوب من خمس إلى ست مرات ، حتى يصبح المحلول عكرا ، لتشكيل مستحلب. قم بعمل ماصة هذا المستحلب بعناية أعلى واجهة الزيت والماء المعدة مسبقا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 6,000 جم لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. قم بتبريد العينة إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. الآن ، استخدم ماصة لإزالة طبقة الزيت العلوية برفق ، مع ترك 100 إلى 200 ميكرولتر من المحلول للتصوير. قطع طرف الماصة بزاوية. استخدمه لاسترداد 50 إلى 100 ميكرولتر من محلول GUV من قاع الأنبوب. لتغليف الأكتين مباشرة في صفيحة مكونة من 96 بئرا ، امزج 198 ميكرولترا من الجلوكوز المولي مع 802 ميكرولتر من الماء لتحضير محلول جلوكوز خارجي يطابق الأسمولية لمزيج الأكتين الداخلي. قم بتخميل بئر من صفيحة 96 بئرا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 10 جرام لكل لتر BSA إلى البئر. بعد حضانة لمدة 10 إلى 15 دقيقة ، اغسل البئر خمس مرات ب 100 ميكرولتر من المحلول الخارجي. اترك 100 ميكرولتر من الغسيل النهائي. الآن ، أضف برفق 50 ميكرولترا من مزيج الدهون والزيت إلى البئر عن طريق وضع الماصة على الجدار الجانبي لضمان الطبقات الصحيحة فوق المحلول الخارجي. في أنبوب منفصل ، أضف 100 ميكرولتر من الدهون في الزيت ، واحتضنها. أضف 2.5 ميكرولتر من محلول الأكتين النهائي إلى أنبوب الدهون والزيت المحتضن ، مما يسمح له بالغرق كقطرة. اضغط برفق على قاع الأنبوب من 10 إلى 20 مرة ، حتى يصبح الخليط عكرا. قم بسحب المستحلب برفق في وسط طبقة الزيت الأحادية في البئر ، دون كسر الواجهة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة 96 بئرا عند 200 جم لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اترك الطبق يبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل التصوير. تم الحصول على حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة ، أو GUVs ، مع أغشية غير مختلطة في مجالات مضطربة بالسائل وسائلة ، وإنتاجية عالية من الحويصلات التي يتراوح حجمها بين خمسة و 30 ميكرومتر. تم تلخيص شبكات FtsZ داخل GUVs وتم توطينها بشكل تفضيلي في مجالات الأغشية المضطربة بالسائل في وجود GTP و Ficoll 70. ظهرت شبكات الأكتين ، عند إعادة تشكيلها ، على شكل حزم رفيعة تلتصق بالغشاء ، وتشكل هياكل متناثرة تشبه الويب. بدون دهون بيوتينيل ، فشلت حزم الأكتين في الالتصاق بالغشاء ، وبدلا من ذلك ظلت صلبة ومستقيمة داخل تجويف الحويصلة. في ظل ظروف الطرد المركزي الأعلى ، تتراكمت الحويصلات التي تحتوي على الأكتين ميوسين في بنية تشبه الأنسجة المعبأة في بئر الإنتاج.