الكشف عن التمثيل الغذائي في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية باستخدام الرنين المغناطيسي النووي مفرط ^{الاستقطاب 13}درجة مئوية

قمنا بتطوير طريقة غير جراحية لقياس التمثيل الغذائي في المصل في الوقت الفعلي باستخدام تقنيات الرنين المغناطيسي النووي المتقدمة مفرطة الاستقطاب. هدفنا هو إنشاء أدوات يمكن الوصول إليها لتطبيقات البحث البيولوجي المختلفة. تم الإبلاغ عن العديد من أنظمة الرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب لعملية التمثيل الغذائي في الدم. ومع ذلك ، لم تكن البروتوكولات الموحدة والقابلة للتكرار لتنفيذ البحوث على نطاق أوسع متاحة حتى الآن.

يعزز بروتوكولنا إمكانية الوصول باستخدام المكونات التجارية المتاحة. كما نقدم التحقق الشامل ، بما في ذلك مزايا خلط النظام وقدرات القياس المتكررة للتكيف على نطاق أوسع. تتيح نتائجنا تتبع التغيرات الأيضية الديناميكية في الخلايا الحية في الوقت الفعلي دون تشتيت الانتباه. هذا يفتح إمكانيات جديدة لدراسات الأدوية طويلة الأجل في تطبيقات مسبار التمثيل الغذائي المتنوعة.

نهجنا له قيود ، بما في ذلك خيارات المشاكل ومتطلبات الأتمتة. سيؤدي حل التحديات إلى إنشاء تقنيات قياس التمثيل الغذائي الخلوي وإثراء جهود أبحاث DNP في مختبرنا في المستقبل.

[راوي] للبدء ، أضف ملليلترين من محلول التربسين EDTA من الحجم إلى الحجم 0.25٪ إلى طبق 10 سم. قم بإمالة الطبق برفق للتأكد من تغطية السطح بالكامل. ثم استنشق محلول حمض التربسين الزائد إيثيلين ديامين. ضع الطبق في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية واحتضنه لمدة دقيقتين. ثم أضف 10 ملليلتر من وسط الثقافة إلى الطبق. باستخدام ماصة ، قم بسحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا عن السطح وتجميع تعليق الخلية بالكامل في أنبوب مخروطي 15 مل. الآن خذ ما يقرب من 10 ميكرولتر من معلق الخلية وقم بتحميله في عداد الخلية لتحديد عدد الخلايا. تأكد من أن العدد المقاس يؤكد إنتاجية تبلغ حوالي 10 ملايين خلية أو اضبط حسب الحاجة. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية المتبقي عند 120 × جم لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، استنشق وتخلص من الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية الناتجة في أربعة ملليلتر من محلول ألجينات الوزن إلى الحجم بنسبة 2٪ ، والماصة ببطء لتقليل تكوين الفقاعات. أضف الآن 10 ملليلترا من محلول كلوريد الكالسيوم 50 ملليمولار إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلترا. قم بتثبيت المحقنة على غطاء أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على محلول كلوريد الكالسيوم. اسحب 300 ميكرولتر من خليط ألجينات الخلية في حقنة 0.5 ملليلتر مزودة بإبرة ثلاثية المقاييس 10 ملم. ثم أغلق أنبوب الطرد المركزي بإحكام مع تثبيت المحقنة على الغطاء ، وضع المجموعة في جهاز الطرد المركزي لتدور برفق عند 200 × جم لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية بعد الطرد المركزي وأعد تعليق الجل الناتج في وسط الاستزراع. بعد ذلك ، باستخدام ماصة باستور ، انقل الجل المغلف بالخلية إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي وأدخل تركيبات الإسفنج لضمان إحكام الإغلاق. قم بتسخين الخزان المتوسط الذي يحتوي على 5٪ من أكسيد الديوتيريوم من الحجم إلى الحجم في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. ابدأ الدورة الدموية بمعدل حوالي 500 ميكرولتر في الساعة لتحقيق الاستقرار في الظروف. افحص الإعداد للتأكد من عدم وجود تسرب قبل المتابعة. أضف 18 ميكرولتر من حمض البيروفيك المصنف على الكربون 13 بتركيز 14.2 مولار مخدر مع 25 ملليمولار OX063 إلى قارورة عينة. قم بتوصيل القارورة بمسار السوائل لنظام مستقطب الاستقطاب النووي الديناميكي. بعد ذلك ، أدخل القارورة المتصلة في وحدة التجويف الخاصة بالمستقطب النووي الديناميكي. قم بتطبيق تشعيع الميكروويف عند حوالي 188 جيجاهرتز بقوة 22 مللي واط لمدة 60 إلى 80 دقيقة. استخدم مطياف الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة المدمج في نظام الاستقطاب النووي الديناميكي لمراقبة شدة إشارة الكربون 13. سجل بيانات الإشارة كل خمس دقائق باستخدام برنامج التحكم في الأنظمة. الآن قم بإذابة العينة المستقطبة بسرعة في 3.2 مل من عازلة الذوبان المسخنة مسبقا إلى درجة الحرارة البيولوجية. قم بتحميل العينة المحضرة في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي وأدخل الأنبوب في مطياف. على وحدة تحكم الرنين المغناطيسي النووي ، ابدأ الإجراء الآلي لإجراء القفل والضبط والمطابقة والوميض مع العينة في مكانها لضمان الدقة الطيفية المثلى واستقرار الإشارة. قم بتحميل تسلسل اكتساب نبضة الكربون 13 مع تمكين فصل البروتون باستخدام إعداد مثل 13-CPD. اضبط زاوية الوجه على 90 درجة بنبضة ميكروثانية واحدة تحمل علامة P1. بعد ذلك ، حدد وقت الاستحواذ على أنه 1.376 ثانية ، والعرض الطيفي على أنه 23,663 هرتز ، ونقاط الاستحواذ ، أو TD ، على أنها 65,536. اضبط تأخير الاسترخاء D1 على صفر ثانية. تخصيص زيادات زمنية قدرها 150 ل TD1 للحصول على 150 طيفا متتابعا في الأسلوب الزائف 2 بعد، وضبط كسب المستقبل على قيمة منخفضة، مثل قيمة واحدة تقريبا، لتجنب تشبع الإشارة الناجم عن العينات شديدة الاستقطاب. الآن أوقف المضخة التمعجية لإيقاف دوران الوسط مؤقتا قبل حقن المحلول شديد الاستقطاب من خلال أنبوب المدخل. ابدأ الاستحواذ الطيفي قبل حوالي 10 ثوان من إذابة الركيزة شديدة الاستقطاب لضمان التقاط الإشارة عند الوصول إلى موقع الكشف. عندما يخرج المحلول من مستقطب الاستقطاب النووي الديناميكي ، اسحب مليلترا واحدا منه في حقنة. قم بتبديل الصمام ثلاثي الاتجاهات عند مدخل المفاعل الحيوي إلى الموضع B لتوجيه المحلول شديد الاستقطاب إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. بعد اكتمال الحقن ، قم بتبديل الصمام مرة أخرى إلى الموضع A لاستئناف الدوران المتوسط ومنع أي تدفق عكسي. أخيرا ، تأكد من أن الحقن كان ناجحا بعد ملاحظة زيادة في إشارة اضمحلال الحث الحر على برنامج الاستحواذ. تأكد من وصول المحلول النهائي إلى درجة حرارة تتراوح بين 308 و 313 كلفن ودرجة حموضة تبلغ حوالي سبعة قبل نقله لقياس الرنين المغناطيسي النووي. تم الحصول على أطياف الكربون 13 NMR مفرطة الاستقطاب لنفس العينة المغلفة بخلية SCCVII على فترات 1.5 ساعة لتقييم جدوى القياسات غير المدمرة المتكررة. أظهر قياس الرنين المغناطيسي النووي الأول زيادة ملحوظة في إشارة اللاكتات ، مما يشير إلى تحويل التمثيل الغذائي النشط من البيروفات إلى اللاكتات. كشفت القياسات اللاحقة على فترات 1.5 ساعة عن انخفاض تدريجي في شدة إشارة اللاكتات ، مما يشير إلى انخفاض نشاط التمثيل الغذائي بمرور الوقت. في خلايا HeLa ، أكدت القياسات الأولية نجاحا في تحويل البيروفات إلى اللاكتات مع قمم إشارة يمكن تمييزها بوضوح. على الرغم من أن الإشارة انخفضت تدريجيا بسبب استرخاء T2 ، إلا أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء ظلت كافية طوال فترة الاستحواذ التي تبلغ 60 ثانية ، مما يشير إلى أن البروتوكول الحالي قابل للتطبيق على نطاق واسع ويمكن أن يكون بمثابة أداة متعددة الاستخدامات لتحديد ملامح التمثيل الغذائي في الوقت الفعلي في أنواع مختلفة من الخلايا.