توصيف التصوير الحي لحركات السنترومير أثناء الطور الانتصافي الذكري في نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا

تستكشف أبحاثنا الانقسام المنتزي النباتي، بهدف اكتشاف آليات جزيئية توجه التعرف على الكروموسومات المتماثلة، ومحاذاتها، واقترانها أثناء التقدم الانقسامي. التحدي هو تصور حركة الكروموسومات في الملفات الانقسامية، مما يتطلب تصوير أنسجة حية بدقة عالية وسرعة لتتبع المسارات. للبدء، أزل الفيلم الواقي للفاصل من جانب واحد وضعه في مركز شريحة زجاجية.

ثم أزل الطبقة الواقية الثانية. أودع ثمانية ميكرولتر من ماء الصنبور في مركز الفاصل. باستخدام الملقط، اختر نورة من أحد السيقان الرئيسية.

ضع النورة على شريحة جديدة موضوعة تحت مجهر ستيريو مزود بمسطرة. اختر براعم الزهور التي يبلغ طولها حوالي 0.5 مليمتر. باستخدام الإبر الحادة، افتح البراعم بلطف عن طريق فصل السبلات والبتلات للحفاظ على الأنثرات فقط.

انقل المجموعات الإضافية برفق إلى الماء في تجويف الفاصل فور إزالة الكسولز والبتلات لمنع الجفاف. ضع عدة مجموعات أخرى داخل تجويف الفاصل. لتغطية المنزلق بغطاء مع تجنب فقاعات الهواء، أضف ثمانية ميكرولترات من الماء إلى شريحة الغطاء.

ثم اقلب غطاء الغطاء بحذر بحيث تكون قطرة الماء مواجها لتجويف الفاصل. تأكد من أن مجموعات الغطاء الأخرى مغمورة في إجمالي 16 ميكرولتر من الماء، وأن غطاء الغطاء يلتصق جيدا بالفاصل. قم بإعداد المجهر عن طريق إثارة GFP عند 488 نانومتر واكتشافه باستخدام كاشف هجين يتراوح بين 494 نانومتر و547 نانومتر.

ثم قم بتحديد موقع الأنذر باستخدام إضاءة الحقل الساطع. باستخدام قناة الحقل المضيء، حدد المرحلة الانقسامية بناء على شكل الخلايا. تصور العنصر على البرنامج واستخدم إشارة RFP كمؤشر إضافي للمرحلة الانقسامية للخلايا.

لأداء عمليات الاقتناء المستمرة، اضبط الفترة الزمنية على صفر في قسم الزمن. ثم استخدم وحدة النقاط لتتبع النقاط تلقائيا. اختر قناة المصدر الخضراء واضبط قطر XY على ميكرومتر واحد للسنترومير المميز GFPCENH3.

ثم يعدل جودة الكشف بناء على شدة الإشارة باستخدام الرسم البياني في أسفل نافذة التحكم. استخدم خوارزمية تتبع الحركة الانحدارية الذاتية لتتبع مسارات المركز المركزي وتصور جميع المسارات لتمييز الخلايا الانقسامية عن الأنسجة الجسدية بسهولة. بعد ذلك، استخدم وحدة النقطة لتتبع النقاط مع مرور الوقت على النواة المختارة.

حدد منطقة اهتمام باختيار مقطع الخيار فقط منطقة اهتمام وقم بتتبع فوري داخلها. اختر منطقة اهتمام تشمل النواة بشكل صحيح في جميع الأبعاد الثلاثة ومع مرور الوقت. في مخطط النساطي، استخدم عارض العرض ثلاثي الأبعاد الخاص بالبرنامج لتصور جميع المسارات.

قم بإزالة المسارات خارج الخلية الميخية المحللة عن طريق تحديدها والضغط على زر الحذف على لوحة المفاتيح. في وضع التحرير، احذف أو أضف كائنا، لضمان إضافة الكائن في المستوى الصحيح. في وضع تعديل المسارات، قم بربط الكائنات الجديدة يدويا على مخطط النسب بعد تحليل الخلية بشكل ثلاثي الأبعاد بشكل شامل.

احسب السرعة اللحظية في كل خطوة زمنية لمراقبة التغيرات في سرعة الحركة مع مرور الوقت. احسب زاوية الدوران كتغير اتجاه الحركة بين خطوات زمنية متتالية لكشف أنماط المسار. احتفظ بالنتيجة مع السرعة الفورية.

احسب نسبة الوصول باستخدام متتبع الخلية لقياس مدى تحرك الجسم المتتبع بالنسبة لموقعه البدئي، مما يشير إلى سلوك استكشافي. احسب متوسط السرعة لكل مسار لتلخيص خصائص الحركة عبر فترة المراقبة. احسب متوسط زاوية الدوران لكل مسار لتحليل الحركة والاتجاهات والأنماط السلوكية وتخزين النتيجة.

بعد ذلك، احسب حجم الجليد المركزي في كل خطوة زمنية لقياس التشتت المكاني للمركزات حول موقعها المتوسط. استخدم التغيرات في حجم المركز المركزي مع مرور الوقت لتقييم الاتساق العالمي عبر مسارات السنترومير وتخزين النتيجة. حساب الارتباط السريع لتحليل العلاقات بين ديناميكيات حركة الأجسام المتتبعة المختلفة كاشفا عن سلوكيات منسقة محتملة.

ثم يحسب متوسط الإزاحة المربعة لكل مسار لقياس متوسط المسافة المربعة التي يقطعها السنتروميرات خلال فترة زمنية معينة. أظهرت السنتروميرات الانقسامية سرعة متوسطة أعلى بشكل ملحوظ تبلغ 109.35 نانومتر في الثانية مقارنة بالسنتروميرات الجسدية. أظهرت السنتروميرات الانقسامية نطاقا أوسع ونسبة توطئ أعلى مقارنة بالسنتروميرات الجسدية.

اختلفت توزيع زاوية الدوران بين السنترومير الانقسام الانقسام والجسمي. زاد متوسط الإزاحة المربعة للسنتروميرات الانقسام مع مرور الوقت بينما بقيت السنتروميرات الجسدية ثابتة إلى حد كبير. مكن هذا البروتوكول من قياس حركة الكروموسومات الانقسام لأول مرة في الأرابيدوبسيس، كاشفا عن ديناميكيات السنتروميرات الدراماتيكية خلال مرحلة الزيغوتين والباكيتين.

يتيح هذا البروتوكول دراسة حركات المناطق الجينومية خلال الطور المنتصفي ويمكن تكييفه للتطبيق في أنواع نباتية أخرى. تمكن هذه الأعمال من استكشاف حركة الكروموسومات وتفاعل إعادة التركيب، مما يعمق الفهم للآليات التي تدفع التنوع الجيني أثناء تكوين الأمشاج النباتية.