استخراج الهستونات من العينات السريرية للتحليل اللاجيني باستخدام مطيافية الكتلة

نطاق أبحاثنا هو تحليل التغيرات فوق الجينية في عينات السرطان، واكتشاف مؤشرات حيوية تشخيصية وتنبؤية جديدة، وتحديد الهدف المحتمل للعلاج. التحدي الرئيسي في العينات السريرية هو محدودية المواد والقطع الناتجة عن التثبيت. ومع ذلك، مع سير العمل المحسن لدينا وحساسية ال DI، يمكننا قياس ما يصل إلى 50 وحدة PTM هيستونية من 1000 خلية فقط.

نظهر أن مطيافية الكتلة يمكنها قياس تغيرات PTM في الهيستون في العينة السريرية، مما يوفر رؤى حول آلية اللاجينية وتمكين اكتشاف المؤشرات الحيوية وتحديد أهداف الأدوية للعلاجات اللاجينية الدقيقة. بروتوكولنا يلبي الحاجة إلى تحليل دقيق وكمية وحساس على PTM الهيستوني في أنواع مختلفة من العينات السريرية. يعد مطيافية الكتلة مثاليا لتحليل PTM بالهيستون، حيث يوفر اكتشافا غير متحيز، وتحليل شخصي متزامن، وحدوث مشترك على نفس الببتيد، وبالتالي يتغلب على قيود الطرق القائمة على الأجسام المضادة.

للبدء، قم بإذابة الأنسجة المجمدة الطازجة على الثلج وباستخدام مشرط أو شفرة، اقطع قطعة من حوالي 20 إلى 30 ملليغرام تعادل حوالي مليمترين مكعبين من الأنسجة. انقل عينة النسيج المقطوع إلى أنبوب بسعة 1.5 ملليتر. باستخدام المقص، قم بتقطيع النسيج إلى قطع صغيرة.

أضف ملليتر واحد من محلول عزل النوى المحضرة حديثا مع مثبطات البروتيز المحددة وقم بتقطيع الأنسجة مرة أخرى. انقل العينة إلى جهاز تجانس لأسفل (downogenizer). باستخدام المدقة المفكوكة أولا، ثم المدقة المشدودة، قم بتجانس النسيج حتى لا يبقى أي قطع مرئية للعين المجردة.

قم بتصفية العينة المتجانسة عبر مصفاة خلية بحجم 100 ميكرومتر لإزالة بقايا الأنسجة. تقوم بطباعة العينة المصفاة بقوة للأعلى والأسفل باستخدام ماصة بسعة 200 ميكرولتر لإذابة غشاء البلازما. انقل العينة إلى أنبوب جديد بسعة 1.5 مليليتر.

ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي على طاولة وادار بحرارة 2,300 جرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية لتكويث النوى. بعد التخلص من الفائق، أعد تعليق الحبيبة النووية في 50 إلى 100 ميكرولتر من عازل عزل النوى، مع إضافة 0.1٪ SDS لإذابة الغشاء النووي. ثم أضف 250 وحدة من نوكلياز بنزوناز إلى العينة المعلقة لهضم الأحماض النووية.

اخلط جيدا وحضن لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية. للحصول على عينات مجمدة بدرجة حرارة قص مثالية، اغسل الأنسجة بماء الإيثانول وPBS قبل التقطيع واستخراج الهستون. أضف ملليتر واحد من عامل مذيب البرافين إلى عينة FFPE، تؤخذ في أنبوب بسعة 1.5 ملليلتر ودوامة بسرعة قصوى لمدة 30 ثانية حتى يذوب البارافين تماما.

قم بطرد الطرد المركزي بالعينة على حرارة 16,000 جرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الفائقة بعناية باستخدام ماصة مزودة برأس صغير يتجنب الكريات. الآن أضف ملليتر واحد من 95٪ إيثانول إلى الحبيبة والدوامة عند أقصى سرعة لمدة 30 ثانية. قم بطرد مركزي للعينة عند حرارة 16,000 جرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من الفائق.

بعد إعادة ترطيب العينة، أضف 200 ميكرولتر من محلول الاستخراج إلى الحبيبة. توحيد الأنسجة في مخزن الاستخراج عن طريق ممارسة الجنس باستخدام مؤشر رقمي باستخدام رأس دقيق بقطر ثلاثة مليمتر. بعد التجانس، حضن العينة في خلاط حراري وافتح غطاء الأنبوب لفترة وجيزة لترك الفورمالديهايد يتبخر.

بعد الطرد المركزي للعينة، انقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد معنون. قم بإزالة أشرطة الجل المقابلة للوزن الجزيئي لبروتينات الهيستون الأساسية التي تقع بين 10 و18 كيلودالتون باستخدام مشرط. بعد قص أحزمة الجل، استخدم نفس المشرط لنقل قطع الجل المقطوعة إلى أنبوب بسعة 1.5 ملليتر.

لإزالة صبغة الجل، أضف محلول يحتوي على 50٪ من الأسيتونيتريل في ماء مقطر مزدوج وحضن الأنبوب في خلاط حراري بسرعة 1,400 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. جفف قطع الجل بإضافة 100٪ أسيتونيتريل من الجلوس. اخلط في الخلاط الحراري بسرعة 1,400 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد التخلص من السوبرناتان، جفف قطع الجل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في جهاز طرد مركزي مفرغ بالفراغ. بعد ذلك، أضف 15 ميكرولتر من محلول بروبونيكانهيدريد بوزن 7.7 مول، و26 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم الضرس إلى كل أنبوب وحضن. ثم حضن العينة ب 80 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم الضرس الواحد.

ثم اغسل قطع الجل ثلاث مرات بماء مقطر مزدوج وتخلص من السائل بعد كل حضانة. بعد ذلك، أضف 50٪ نتريل أسيتون إلى قطع الجل وحضن بمعدل 1,400 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 100٪ أسيتونيتريل لتجفيف قطع الجل تماما.

حضن في الخلاط الحراري بسرعة 1,400 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من السائل، جفف قطع الجل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في جهاز طرد مركزي مفرغ. أضف أربعة ميكرولترات من محلول التربسين و20 ميكرولتر من محلول الهضم إلى كل أنبوب يحتوي على قطع هلام.

حضن الأنابيب على الثلج لمدة 10 دقائق للسماح لامتصاص التربسين في الهلام. بمجرد امتصاص التربسين بالكامل، أضف 80 ميكرولتر من حاجز الهضم لتغطية قطع الجل بالكامل وحضن الأنابيب طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في خلاط حراري. لاستخراج الببتيدات المهضومة، أضف 100 ميكرولتر من النتريل 100٪ أسيتو إلى كل أنبوب، وحضن بسرعة 1400 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في خلاط حراري.

الآن، اجمع المادة الفائقة بعناية وانقلها إلى أنبوب جديد بسعة 1.5 ملليلتر. بعد تكرار استخراج النيترو الأسيتو مع الجل المتبقي، قم بتجميع المواد الفائقة. تركز الببتيدات المجمعة في جهاز طرد مركزي مفرغ حتى يصبح الحجم بين واحد وخمسة ميكرولتر.

ثم أضف ميكرولترين من بيكربونات ثلاثي إيثيل أمونيوم ضرس واحد، وثلاثة ميكرولترات من محلول فينيل إيزوسيانات. حضن العينة بسرعة 350 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية في خلاط حراري. لإيقاف الاشتقاق، أضف ثمانية ميكرولترات من حمض ثلاثي كلوروأسيتيك بنسبة 1٪ لكل أنبوب.

وأخيرا، قم بتخفيف كل عينة بإضافة 100 ميكرولتر من المخزن A وتحميل العينات المخففة على أطراف مراحل C18 للاستنتاج. تم تحقيق استخراج الهيستون بنجاح من عينات مجمدة طازجة، وعينات مجمدة ب OCT، وعينات FFPE باستخدام سير عمل المعالجة التفاضلية الخاصة بكل نوع من الأنسجة. على الرغم من انخفاض الإثراء ووجود البروتين الخلفي، تم استخراج هيستون H3 وH2A وH2B وH4 بنجاح من عينات FFPE كما يظهر من النطاقات في FFPE1 وFFPE2 في لين، متوافقة مع حوالي ميكروغرام واحد من معيار H3.1.

أظهرت الكروماتوغرافيا السائلة النانوية وتحليل التصلب المتعدد للهيستونات المشتقة من FFPE فصلا ناجحا لببتيدات الهيستون على مدى تدرج مدته 55 دقيقة مع ظهور ذروات زمنية واضحة في كروماتوجرام الأيونات الكلي. أكدت كروماتوغرامات الأيونات المستخرجة الكشف وقياس الأشكال غير المعدلة والمثيلة ل H3 K 4 مع ملفات إخراج منفصلة لكل قيمة M × Z. مما يتيح حساب نسبة الوفرة النسبية لكل تعديل.

أظهر التحليل المقارن لتعديلات الهيستونات بين عينات الورم الطبيعية والورمية زيادات كبيرة في أنواع معينة وانخفاض في أنواع أخرى في أنسجة الأورام.