استخدام أدوات علم الوراثة البصرية LEXY و LINuS وتحليل الصور الآلي لتحديد ديناميكيات النقل النووي للسيتوبلازمات في الخلايا الحية

يدرس مختبرنا التفاعل بين المسام النووية وتنظيم الكروماتين. لذلك ندرس كيف تؤثر المسام النووية على تنظيم الكروماتين ، ولكن أيضا بشكل عكسي ما إذا كان تنظيم الكروماتين يؤثر على وظيفة المسام النووية ، خاصة في النقل النووي الخلاوي. يعد النقل النووي السلولبي عملية سريعة جدا ، لذلك يتمثل أحد التحديات في اكتشاف التغيرات في ديناميكيات النقل النووي في الخلايا الحية.

لا يوجد الكثير من الأدوات المتاحة لمراقبة النقل النووي في الخلايا الحية. من خلال تنفيذ تقنية شبه آلية ومحسنة ، نأمل في تسهيل استخدام هذه الأدوات. يعتمد بروتوكولنا على التعلم العميق.

يحد من الخطأ ويقلل بشكل كبير من الوقت اللازم للتحليل. ما كان سيستغرق يوما في السابق يستغرق الآن ساعة أو ساعتين فقط. للبدء ، قم بتشغيل برنامج FIJI على نظام الكمبيوتر.

حدد المرحلة المستقرة كصورة واحدة ، ومرحلة الإضاءة كصورة ثانية ، ومرحلة الاسترداد كصورة ثالثة. قم بتسلسل الصور الثلاث التي تمثل ثلاث مراحل لإنتاج صورة واحدة. احفظ الصورة المدمجة التي تم الحصول عليها للتقسيم عن طريق الانتقال إلى ملف وتحديد حفظ ك TIFF.

بعد ذلك ، قم بتقسيم قناة mCherry عن طريق تحديد صورة ولون وقنوات مقسمة. ثم احفظ الصورة المنقسمة بالانتقال إلى ملف و حفظ باسم و TIFF. للتحقق من التبييض أثناء الاستحواذ، حدد بشكل تسلسلي Image وStacks وPlot Z-axis Profile.

ثم انقر فوق البيانات ، متبوعا بنسخ مجموعة البيانات الأولى ، والصقه في جدول البيانات المقدم أسفل خلية ملف تعريف المحور Z. الآن ارسم منطقة دائرية ذات أهمية ، تقارب متوسط حجم النواة ، بالنقر فوق تحليل ، متبوعا بالأدوات ، والنقر فوق مدير عائد الاستثمار. أضف عائد الاستثمار واحفظه بالانتقال إلى المزيد والنقر فوق حفظ.

ضع عائد الاستثمار المحفوظ في منطقة خالية من الخلايا أثناء الفاصل الزمني. تأكد من أن متوسط القيمة الرمادية" ضمن تحليل وتعيين القياسات. ثم انقر فوق المزيد ، متعدد المقاييس.

تحقق من قياس جميع الشرائح ال 50 "وعائد استثمار واحد لكل شريحة" وانقر فوق "موافق" لتسجيل الكثافة. انسخ والصق جميع قيم الكثافة المقاسة في جدول البيانات المقدم ضمن خلية خلفية عائد الاستثمار. ثم أغلق الصورة بقناة mCherry فقط وحدد الصورة المحفوظة مع القنوات المدمجة.

افتح الآن المكون الإضافي TrackMate بالنقر بالتتابع على المكونات الإضافية والتتبع و TrackMate. تأكد من أن النقاط الزمنية تتراوح من صفر إلى 49 وانقر فوق التالي. حدد كاشف StarDist وانقر فوق التالي.

اختر القناة الثانية، SiR-DNA، لتجزئة النوى وانتظر حتى تكتمل العملية. اترك المعلمات الافتراضية في نافذة الحد الأدنى وانقر فوق التالي. قم بإنشاء عوامل تصفية باستخدام متوسط الكثافة ، القناة الأولى ، لاستبعاد النوى ذات قيم الإشارة القصوى.

قم بإنشاء عامل تصفية واحد لتحديد القيم فوق الحد المحدد والآخر لتحديد القيم أسفل الحد. وبالمثل ، أضف مرشحين للمنطقة لإزالة الحطام أو الخلايا المحتضرة وانقر فوق التالي. اختر متتبع LAP البسيط وانقر فوق التالي.

بعد ذلك ، اضبط معلمات التتبع. اضبط مسافة الربط القصوى "على 30 ميكرومتر ، ومسافة إغلاق الفجوة القصوى" إلى 15 ميكرومتر ، وفجوة الإطار القصوى لإغلاق الفجوة "إلى ثلاثة. ثم انقر فوق التالي.

بعد العمليات الحسابية ، انقر فوق التالي لتعيين عوامل التصفية على المسارات. لتحديد النوى التي تم تتبعها فقط خلال الدورة الزمنية بأكملها، اختر أكبر عدد من المواقع في المسار وانقر فوق التالي. ثم ضع علامة على عرض أسماء البقع "لتتبع كل نواة في مزيد من التحليلات وتخصيص ميزات العرض الأخرى حسب الرغبة.

في أسفل الصفحة ، انقر فوق المسارات واختر تصدير إلى CSV "لحفظ جدول القياس. أغلق الجدول وتابع بالنقر فوق التالي. انقر الآن فوق التقاط تراكب "كإجراء ، ثم اضغط على التنفيذ ، متبوعا ب OK لإنشاء صورة ذات نوى متتبعة.

احفظ الصورة بالنقر بالتتابع فوق ملف ، حفظ باسم ، واختيار TIFF. لاستيراد ملف TrackMate CSV إلى جدول البيانات المقدم ، انقر فوق علامة التبويب البيانات. ضمن مجموعة الحصول على بيانات التحويل ، انقر فوق من نص / CSV "وانقر فوق استيراد.

انسخ العمود Spot IDB وتتبع IDC والإطار I ومتوسط كثافة القناة 1M، والصقه في الأعمدة من A إلى D من جدول البيانات المتوفر. قم بفرز النتائج أبجديا أولا حسب معرف التسار، النواة الفردية، من الخلية B5، ثم حسب الإطار، النقطة الزمنية، من الخلية C5. الآن افتح GraphPad Prism ، وقم بإنشاء ورقة جديدة ، وانسخ والصق عمود الوقت من جدول البيانات. ثم الصق القيم التي تم الحصول عليها ككثافة نووية نسبية في جدول GraphPad Prism.

لإنشاء الرسم البياني للكثافة النووية النسبية ، انتقل إلى قسم الرسم البياني وحدد XY كعائلة الرسم البياني. ثم اختر النقاط وخط التوصيل بأشرطة الخطأ "كنوع الرسم البياني. في إعدادات المؤامرة ، اختر Mean and Error "و SEM ، وانقر فوق موافق. بعد ذلك ، للحصول على معدل التصدير ، انقر فوق جدول بيانات جديد وأدخل الأوقات بالكسور العشرية فقط للمراحل المستقرة والإضاءة.

الصق القيم التي تم الحصول عليها ككثافة نووية نسبية لهذه المراحل في الجدول. في قسم النتائج ، انقر فوق تحليل XY متبوعا ب "الأسي". ثم اختر الانحدار غير الخطي وانقر فوق موافق. حدد الهضبة متبوعا باضمحلال طور واحد "كنموذج تحت المعلمات.

ثم اختر ثابتا يساوي 2.25 في صورة X0، وثابتا يساوي واحدا يساوي Y0، وثابتا يساوي صفرا للهضبة. أشر إلى أن K يجب أن يكون أكبر من الصفر واضغط على موافق. قم بإنشاء جدول جديد ولصق تبديل قيم K التي تم الحصول عليها. في قسم الرسم البياني، حدد عمود كعائلة الرسم البياني، واختر مخطط الكمان كنوع الرسم البياني.

حدد إظهار جميع النقاط "كمؤامرة وانقر فوق موافق. تم تصور التصدير النووي باستخدام المسبار البصري الوراثي في تصوير الخلايا الحية. في حالة التحكم مع الخلايا المعالجة بالميثانول ، انخفضت كثافة mCherry النووية بشكل حاد بعد إضاءة الضوء الأزرق ، تليها انتعاش تدريجي خلال مرحلة ما بعد الإضاءة. تسببت المعالجة بمثبط التصدير ، اللبتومايسين ب ، في تغيير في الصادرات النووية ، حيث ظلت إشارة المسبار نووية باستمرار طوال جميع النقاط الزمنية.

أظهر التحليل الكمي للكثافة النووية النسبية بمرور الوقت انخفاضا بطيئا حتى الوصول إلى هضبة في نهاية مرحلة الإضاءة. يجب أن تظهر تركيزات اللبتومايسين B المتوسطة صادرا نوويا معتدلا. أكدت معدلات التصدير المحسوبة من بيانات الشدة معدل تصدير أعلى بكثير في الخلايا المعالجة بالميثانول ، ومعدل أقل بكثير مع 0.5 نانومولار ليبتومايسين ب ، وعدم وجود تصدير تقريبا عند ليبتومايسين ب نانومولار واحد.