المجهر التوسعي: تصوير فلوري عالي الدقة باستخدام مجهر تقليدي

نحن علماء أحياء خلوية نحقق في دور الأنابيب الدقيقة ووظيفتها المرتبطة بها في الكائنات النموذجية المختلفة. نهدف إلى دراسة دورها في تنظيم الخلايا، والتشكل الخلوي، والتجسم المهديب، والانقسام. خلال السنوات الخمس الماضية، ساهمنا في فهم التركيب الجزيئي الدائري، لا سيما من خلال استخدام المجهر التوسعي.

وبهذا، نكشف عن الميزة الأساسية لتجميعها ووظيفتها. من خلال دمج المجهر التوسعي مع التثبيت بالتجميد، يتيح بروتوكولنا التصوير عالي الدقة مع الحفاظ على البنية شبه الأصلية للعنصر الخلوي، مما يتغلب على القيود الرئيسية للمجهر فائق الدقة. المجهر التوسعي، هو تقنية منخفضة التكلفة وسهلة التنفيذ توفر الوصول إلى جميع المختبرات بدقة فائقة.

للبدء، استخدم حقنة وإبرة لملء كل أنبوب سعة خمسة مليليتر بملليلتر واحد من الأسيتون الجاف الإضافي تحت غطاء كيميائي. ضع الأنابيب بشكل عمودي في رف معدني وضعها في النيتروجين السائل للتجميد. املأ نصف صندوق بوليسترين سميك الجدران بحجم 30 في 30 سنتيمترا بالثلج الجاف، ثم املأ ديوار من نوع فيتروبوت بالنيتروجين السائل حتى يتوقف التبخر.

الآن، أزل العنكبوت من جهاز الغوص واملأ غرفة الغمر المعدنية بالإيثان السائل. انتظر 10 دقائق حتى يصل الإيثان إلى حالة التوازن. ثم خذ غطاء 12 ملم مع ملقط رفيع وادحه على ورق مناديل لامتصاص أي وسط زائد من الغطاء.

امسك الغطاء في منتصف الطريق باستخدام ملقط مزود بحلقة تثبيت متوافقة مع المكبس التجميد. ضع الملقط الذي يثبت غطاء الغطاء في حامل المكبس بالتجميد، واستخدم ورق واتمان لمسح أي وسط متبق. فعل المكبس الكريو لغرس الغطاء في محلول الإيثان الموجود في الحجرة المعدنية.

ثم انقل الغطاء بسرعة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأسيتون المتجمد. حضن الأنابيب التي تحتوي على الغطاء في الثلج الجاف بزاوية تقارب 45 درجة. ضع الحاوية المغلقة على هزاز مداري مضبوط على 50 إلى 100 دورة في الدقيقة، وحرك طوال الليل عند أربع درجات مئوية لتسمح بارتفاع درجة الحرارة تدريجيا.

بعد ذلك، أزل معظم الثلج الجاف من الصندوق. استمر في التحريك على الهزاز المداري لمدة 45 دقيقة إضافية للسماح بارتفاع درجة الحرارة من ناقص 80 درجة مئوية إلى 20 درجة مئوية ناقص 20 درجة مئوية. افتح وأغلق كل أنبوب لفترة وجيزة لتحرير الضغط الداخلي.

ثم انقل كل غطاء إلى صفيحة تحتوي على 12 بئر أو وعاء مناسب مملوء مسبقا بمحلول إيثانول مبرد مسبقا بنسبة 100٪. بعد حضانة مدتها خمس دقائق، أعد ترطيب الغطاء عبر سلسلة إيثانول متدرجة. بعد نقل أغطية الألواح إلى PBS، ضعها تحت المجهر.

استخدم ملقطا دقيقا لخدش السطح بلطف وتوجيه جميع الأغطية بحيث يكون الجانب الصحيح مواجها للأعلى. ضع الغطاء في صفيحة بأربع آبار مملوءة بمحلول 0.5 إلى 1 ملليلتر من 2٪ أكريلاميد و1.4٪ فورمالديهايد. ثم حضن الغطاء في هذا المحلول عند درجة حرارة 37 درجة مئوية دون تحريك.

بعد ذلك، قم بإذابة 10٪ من APS ومحلول التجلي على الثلج لمدة 10 دقائق قبل التجل. جهز غرفة رطبة باستخدام طبقة رقيقة من الأنسجة الرطبة والباراغليم. ثم خزنها عند أربع درجات مئوية.

بعد 10 دقائق، ضع الحجرة الرطبة على كتلة باردة لاستخدامها أثناء التجل. الآن، أزل الغطاء من محلول تثبيت البروتين ومسح السائل الزائد باستخدام ورق المناديل في مرتين متتاليتين. أضف APS إلى محلول التجلي للوصول إلى تركيز نهائي 0.5٪ ودوامة لمدة ثوان إلى ثلاث ثوان.

ثم قم بعمل قطرتين بسعة 35 ميكرولتر على البارافيلم في الحجرة الرطبة وضع كل غطاء بلطف فوق قطرة، بحيث تواجه الخلايا إلى الأسفل داخل محلول التجل. انقل الحجرة الرطبة إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. لإزالة الطبيعة، استخدم أداة ثقب الخزعة بقطر 0.4 سنتيمتر لاستخراج قطع الجل، وضعها في صفيحة بستة آبار مملوءة بملليلتر واحد من مخزن إزالة الهواء.

حرك اللوحة لمدة 10 إلى 15 دقيقة حتى تنفصل الجل عن الغطاء الداخلي، وانقل قطع الجل المنفصلة إلى أنابيب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليلتر مملوءة بمخزن إزالة الطبيعة الطازج. حضن الجل لمدة 90 دقيقة عند 95 درجة مئوية. بعد الحضانة، انقل الجل إلى ماء مقطر مزدوج لمدة 10 دقائق للغسيل.

قس قطر الجل باستخدام ورق المليمتر لتقييم عامل تمدد الهلام. غط الغطاء النظيف بحوالي 200 ميكرولتر من محلول البولي ليسين. حضن الغطاء لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة، ثم اغسلها ثلاث مرات بماء مقطر مزدوج لإزالة أي بولي ليسين زائد.

بعد جفاف الأغطية، خزنها عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام الإضافي. ضع الجل بشكل صحيح بحيث تكون الخلايا متجهة للأعلى، على ورق خال من الوبر واتركها تجف لإزالة الماء الزائد. وأخيرا، قم بتركيب الجل المجفف بحيث تكون الخلايا متجهة للأسفل على أغطية مغلفة ب Poly-D-Lysine.

حافظ التثبيت بالتبريد على شبكة الميتوكوندريا في خلايا RPE1 بشكل أكثر فعالية من تثبيت PFA، كما أظهرت تلوين NHS Ester وATP5A، وسمح بحل الكريستات الميتوكوندرية التي لم تكن مرئية مع تثبيت PFA. أدى التثبيت بالتبريد إلى حفظ أفضل للأنابيب الدقيقة الديناميكية، بما في ذلك الأنابيب الدقيقة السيتوبلازمية والنجمية في خلايا RPE1 المنقسمة، مقارنة بتثبيت PFA. تريبانوزوما بروساي، حافظ التبريد على بنية الميتوكوندريا والبنية الخلوية العامة بشكل أفضل مقارنة بتثبيت PFA، كما ظهر في تلوين الإستر ب TDH وNHS.

بالإضافة إلى ذلك، حافظ التبريد على الشبكة الإندوبلازمية بشكل أفضل من تثبيت PFA المعتمد على تلوين BIP. لوحظت تشققات في خلايا RPE1 المثبتة بالتبريد، لكنها لم تعطل البنية الفائقة للعضيات، مثل الميتوكوندريا أو الأنابيب الدقيقة. أشارت التركيبة النارية الضعيفة إلى هياكل فقاعة وأنابيب دقيقة متموجة، مصحوبة بفقدان سلامة العضيات الغشائية.

كانت جودة التمدد تعتمد على وضوح محاليل أكريلات الصوديوم، حيث تبدو المحاليل القابلة للاستخدام عديمة اللون أو صفراء قليلا وشفافة، بينما كانت المحاليل غير القابلة للاستخدام تبدو عكرة وبرتقالية.