وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

مرحبًا بكم في مختبر الدكتور Hiku Alge Blink. نود أن نشكر معهد كاليفورنيا للطب التجديدي على تمويل هذا المشروع. يتيح وسم الخلايا الجذعية بعامل تباين فلوري تتبع الخلايا الجذعية المزروعة داخل الجسم الحي.

يسمح التصوير البصري اللاحق للخلايا الجذعية الموّسمة بإجراء دراسات طولية حيث يمكن مراقبة هجرة الخلايا في الجسم الحي بطريقة غير جراحية. سيوضح لك هذا الفيديو كيفية وسم كل من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والخلايا الجذعية الميزنشيمية البشرية باستخدام الأصباغ الفلورية. مرحباً، أنا صوفي بودينغتون من مجموعة أبحاث عوامل التباين في قسم الأشعة بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو.

أود اليوم أن أعرض لكم تقنيتين مختلفتين لوسم الخلايا الجذعية باستخدام عوامل تباين فلورية. الأولى لوسم الخلايا الجذعية الميزنشيمية باستخدام الصبغة الفلورية DID، والأخرى لوسم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية باستخدام endign ingra. لذا، اسمحوا لي أن أبدأ بعرض تقنيتنا لوسم الخلايا الجذعية الميزنشيمية البشرية باستخدام DID.

لبدء إجراء وسم الخلايا الجذعية الميزنكيمية، يجب علينا القيام بعملية التثبيت والعد للحصول على معلق يحتوي على عدد محدد من الخلايا. ونظراً لأن هذه تقنية قياسية في زراعة الأنسجة، فلن نعرضها بالتفصيل. نريد تعليق الخلايا التي سنقوم بوسمها بكثافة تصل إلى 1 مليون خلية لكل مليلتر في وسط زراعة خالٍ من المصل.

أولاً، نضيف 5 µL من عامل التباين DID لكل 1 mL من معلق الخلايا. الآن نقوم بمزج المحلول عن طريق السحب والضخ اللطيف بالماصة، ثم تُحضن الخلايا مع محلول الوسم في طبق سداسي الفجوات منخفض الالتصاق عند 37 °C لمدة 20 دقيقة. وبمجرد اكتمال عملية التحضين البسيطة، يجب علينا الآن نقل محلول الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 mL.

نقوم بطرد المزيج مركزياً عند 400 RCF لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، نسحب وسط الوسم بعناية لضمان عدم تعكير الراسب. ثم نقوم بغسل الخلايا باستخدام PBS.

نقوم بسحب الخلايا وإطلاقها باستخدام الماصة لضمان تفكيك تكتل الخلايا. أما الخطوتان الأخيرتان، فنكررهما مرتين إضافيتين بحيث نحصل على إجمالي ثلاث خطوات غسيل.

الآن نقوم بعدّ الخلايا وإجراء اختبار trypan blue لتحديد حيوية الخلايا. بعد تحديد حيوية الخلايا، تصبح خلاياكم الآن جاهزة للتصوير في جهاز التصوير البصري. لبدء إجراءات وسم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، يجب علينا أولاً تحضير عامل التباين المعروف باسم Indocyanine Green.

بعد ذلك، نقوم بخلطه مع عامل عفن البروتومين. في البداية، نقيس ملم واحد من مسحوق الإندوسيانين الأخضر ونذيبه في 100 µL من DMSO. ثم نضيف 400 µL من DMEM الذي يحتوي على 10% FCS إلى الخليط ونرجّه جيداً، مما يمنحنا تركيزاً قدره 2 mg/mL من الإندوسيانين الأخضر.

بعد ذلك، نضيف عامل ترانسفكشن (transfection) وهو البروتامين، الذي يعمل كناقل لعامل التباين، مما يسمح له بدخول الخلية بكفاءة أكبر. الآن نقوم بخلط 5 µL من كبريتات البروتامين بتركيز 10 mg/mL مع 300 µL من ICG و 300 µL من DMEM الخالي من المصل. الآن نقوم برج محلول الترانسفكشن الجديد لمدة خمس دقائق للسماح بتكوين المعقدات.

بعد ذلك، نقوم بشفط الوسط القديم وإضافة 10 milliliters من DMEM المسخن مسبقاً إلى الخلايا. ثم نضيف محلول البروتامين ICG الذي تم تحضيره مسبقاً إلى الخلايا ونبدأ عملية التحضين لمدة ساعة واحدة عن طريق وضع الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. وبعد اكتمال التحضين، نقوم بإخراج الطبق من الحاضنة، وشفط محلول الوسم، وغسل الخلايا عن طريق شطف الطبق باستخدام خمسة milliliters من PBS.

يتم بعد ذلك معالجة الخلايا بإنزيم التربسين لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. وسيساعد رجّ الطبق على رفع الخلايا وتحويلها إلى معلق. والآن نقوم بالسحب والضخ بلطف باستخدام الماصة لتفكيك المستعمرات المتبقية.

نقوم بتثبيط مفعول التريبسين بإضافة كمية مساوية من وسط DMEM الذي يحتوي على 10%FCS إلى الطبق. بعد ذلك، ننقل محلول الخلايا إلى أنبوب سعة 15 ملليمتر ونقوم بطرد المحلول مركزياً عند 400 RCF لمدة خمس دقائق. ثم نعيد تعليق الخلايا في وسط غذائي كامل.

يمكننا الآن التخلص من التكتلات أو المعقدات المتبقية عن طريق تمرير الخلايا عبر مصفاة خلايا بقطر 40 ميكرومتر. وبمجرد الحصول على محلول خلوي خالٍ من التكتلات، نقوم بشفط الوسط القديم وإعادة تعليق الراسب في وسط خلايا جذعية جنينية بشرية كامل ومُدعم مسبقاً. وفي هذه المرحلة، نحتاج إلى فصل خلايا التغذية الفأرية عن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.

يتم القيام بذلك لضمان تصوير الخلايا الجذعية فقط في مرحلة لاحقة. ولتحقيق ذلك، ننقل محلول الخلايا إلى طبق بتري بقطر 10 centimeter مطلي بالجيلاتين. نضع الطبق في الحاضنة عند درجة حرارة 37 °C ونتركه لمدة 45 دقيقة.

خلال هذا الوقت، تأكد من عدم تحريك الطبق. الآن ستلتصق الخلايا المغذية بالطبق بينما لن تلتصق الخلايا الجذعية. نقوم بنقل المحلول من طبق بيتري، وبذلك نحصل الآن على محلول خلايا مفردة مُعلمة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.

يمكننا الآن عد الخلايا وإجراء اختبار Trypan Blue عليها. وبعد التأكد من حيويتها، تصبح خلايانا جاهزة للتصوير. وتُظهر الشريحة مثالاً لكيفية تصور الخلايا الجذعية في الجسم الحي (in vivo) في الفئران بعد وسمها بعامل تباين فلوري وحقنها عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP injection).

أظهرت عمليات الفحص بالتصوير البصري المتسلسل تراكم الخلايا الأولي في الرئتين، يليه إعادة توزيع في الكبد ونخاع العظام في الأطراف والغدة الدرقية. كما يمكن استخدام العلامة الفلورية للتصوير المباشر للخلايا الجذعية المزروعة في عينات التشريح المرضي باستخدام المجهر الفلوري. لقد شرحنا لكم للتو كيفية وسم الخلايا الجذعية بعوامل تباين فلورية عند إجراء عملية وسم الخلايا.

من المهم تذكر توحيد جميع الخطوات؛ نقوم بذلك لضمان كفاءة وسم متسقة وحيوية خلوية مستقرة، بحيث يمكن مقارنة النتائج من تجارب مختلفة. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في عملية وسم الخلايا.