تقنية الحقن تحت الشبكية عبر الصلبة طفيفة التوغل في الفأر

تعد الحقن تحت الشبكية أداة مهمة للتحقيقات قبل السريرية لعلاجات أمراض الشبكية الوراثية. في هذا الفيديو ، نقدم تقنية حقن تحت الشبكية محسنة طفيفة التوغل في الفئران. تعد الحقن تحت الشبكية عبر الصلبة طريقة ممتازة لتوصيل المواد إلى المستقبلات الضوئية و RPE.

ومع ذلك ، فإن هذه التقنية تمثل تحديا تقنيا وتدعو إلى تطوير بروتوكول محسن لزيادة قابليتها للتكرار وإمكانية الوصول إليها. تشمل التحسينات التي أجريناها تطوير منظار جفن الفأر ، وإعطاء الأتروبين قبل الجراحة ، وإنشاء بضع التصلب الدقيق باستخدام سكين الماس وتحسين حجم الإبرة ونهج الحقن. نأمل أن يؤدي تناسق طريقتنا وقابليتها للتكرار وتغطية التنبيغ الممتازة والحد الأدنى من الضرر الجراحي إلى تحسين إمكانية وصول الحقن تحت الشبكية إلى المجتمع العلمي.

تجعل التحسينات التي أجريناها من الأسهل والأسرع إجراء الحقن تحت الشبكية في الفئران ، وتقليل التباين التجريبي ، وتحسين معدلات نجاح الحقن. ستسهل هذه التقنية أبحاث شبكية العين الانتقالية قبل السريرية في المستقبل. للبدء، يجب تطبيق ملليغرام واحد لكل كيلوغرام من الأتروبين داخل الصفاق بحجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر قبل 30 دقيقة من إجراء الحقن تحت الشبكية.

قم بتحميل إبرة زجاجية بالحجم المطلوب لمحلول الحقن. قم بتوصيل الإبرة بالحاقن الصغير واضبط ضغط التعويض على خمسة هيكتوباسكال لمواجهة عمل الشعيرات الدموية. ضع الفأر المخدر تحت مجهر تجسيمي تشريح.

ضع قطرة من 0.5٪ بروباراكايين على العين لتحقيق التخدير الموضعي. يتم وضع قطرة من خليط يحتوي على 0.2٪ سيكلوبنتولات و1٪ فينيل إيفرين على العين لتوسيع حدقة العين لتصوير ما بعد الجراحة للفقاعة تحت الشبكية ولتقليل النزف أثناء الجراحة. باستخدام منظار سلكي مصغر مخصص ، قم بكشف اللقب العلوي وشل حركة المنظار لتمكين تراجع الجفن العلوي بدون استخدام اليدين.

باستخدام مقص Vannas بزاوية ، قم بعمل زوج من شق القزحية على بعد حوالي ملليمتر واحد من خلف الحف في الملتحمة العلوية وكبسولة تينون لفضح الصلبة العلوية. قم بإزالة أي بقايا من كبسولة تينون بعناية فوق موقع الحقن. الآن أمسك الحافة الأمامية لبضع محيط الملتحمة وبضع الوتر باستخدام ملقط مسنن مقفل.

ثم قم بمسح الكرة الأرضية برفق لفضح الصلبة العلوية. ضعي على الفور قطرة من المحلول الملحي المتوازن على العين للحفاظ على ترطيب الصلبة العارية وتحقيق تكبير بصري أكبر. باستخدام سكين ماسي ، قم بإجراء بضع التصلب الدقيق عند موضع الساعة 12 تقريبا وعلى بعد ملليمتر إلى ملليمترين من النطر.

وضع الشفرة بشكل عرضي على الصلبة للتأكد من أن بضع التصلب صغير وضحل. استخدم إسفنجة جراحية لإزالة جميع المحلول الملحي المتوازن برفق من سطح العين. أمسك شطبة الإبرة لأسفل بزاوية ضحلة إلى الصلبة وأدخل الطرف ببطء في بضع التصلب ، وتقدم من 0.5 إلى ملليمتر واحد فقط للوصول إلى الفضاء تحت الشبكية دون اختراق شبكية العين.

أثناء تثبيت الإبرة ، ابدأ الحقن عند 500 هكتوباسكال باستخدام دواسة القدم وحافظ على الضغط المستمر لمدة 15 ثانية. قم بإزالة الإبرة ولاحظ الارتجاع الجزئي للمحلول المحقون من خلال موقع بضع التصلب ، مما يشير إلى الولادة الناجحة لأن مساحة تحت الشبكية لا يمكن أن تستوعب الحجم الكامل للمحلول المحقون. قم بإزالة ملقط القفل ومنظار الجفن بعناية دون الضغط على الكرة الأرضية لتجنب الارتجاع الإضافي.

مباشرة بعد الحقن ، ضعي كمية وفيرة من مرهم العين المزلق على العين للمساعدة في تصور الفقاعات تحت الشبكية. كانت الفقاعة تحت الشبكية مرئية بوضوح في OCT مباشرة بعد الحقن عبر الصلبة ، مما يؤكد الولادة الناجحة. لتقييم ظهارة صبغة الشبكية ، أو RPE ، تم حقن حقن AAV-8 dystrophin 1-GFP ، مما أدى إلى مضان أخضر واسع النطاق عبر طبقة الظهارة ، مما يشير إلى نقل RPE فعال وواسع باستخدام نهج الصلبة.

أدى AAV-8 rhodopsin GFP إلى إشارة فلورية خضراء قوية في المستقبلات الضوئية للقضيب ، مرئية في كل من المقاطع العرضية ومناظر قاع العين ، مما يشير إلى الاستهداف والتعبير الناجح في خلايا المستقبلات الضوئية. أنتج AAV8-CAG-mCherry مضانا أحمر عريضا عبر طبقات الشبكية ، مما يدل على قدرة هذه التقنية على دعم التعبير الجيني المعدل وراثيا المعمم بما يتجاوز أنواع خلايا معينة. أظهر النشاف الغربي لمحللات الشبكية أيضا تعبيرا قويا عن البروتين الفلوري الأخضر مع أعلى المستويات المقابلة لمركز فقاعة الحقن ، مما يتحقق من صحة نقل المستقبلات الضوئية باستخدام AAV8 rhodopsin GFP.

يسمح تحسين عيار AAV باستخدام تحليل التألق المناعي لأقسام الشبكية باختيار العيار الفيروسي الذي يحقق نقل ما يقرب من 90٪ من الخلايا المستهدفة. على سبيل المثال ، في هذه الحالة ، أنتج تخفيف واحد إلى 10 مخزون فيروسي AAV8 rhodopsin GFP تعبيرا جينيا معدلة في جميع المستقبلات الضوئية تقريبا. على النقيض من ذلك ، أدى التخفيف من واحد إلى 100 إلى عدم كفاية معدل النقل.

أظهر مخطط كهربية الشبكية أن الحقن عبر الصلبة حافظت على وظيفة الشبكية الطبيعية بينما أدت الحقن عبر الشبكية إلى انخفاض كبير في استجابات الموجة A والموجة B ، مما يشير إلى تلف الشبكية.