الفحص المجهري متعدد التوافقات التوافقي المتزامن الخالي من الملصقات

يلتقط الفحص المجهري متعدد التوافقيات الذاتي الخالي من الملصقات المتزامن ، أو الفحص المجهري SLAM ، معلومات فريدة في العينات البيولوجية عن طريق قياس التفاعلات غير الخطية مع الضوء. في مختبرنا ، نستخدم هذه التقنية لدراسة الحياة والمرض على نطاق مجهري. نلاحظ تحولا نحو التصوير متعدد الوسائط الخالي من الملصقات ، مما يوفر رؤى أكثر ثراء في الهياكل والديناميكيات الخلوية والأنسجة ، مع تجنب السمية وتمكين التناقضات والارتباطات التكميلية عبر الطرائق.

تكتسب المجاهر غير الخطية الحديثة الخالية من الملصقات إشارة واحدة في كل مرة ، مما يخاطر باختلال المحاذاة وتلف الصور والكثير من العمليات المتزامنة. يتغلب SLAM على هذه المشكلات من خلال تمكين تباين متعدد الوسائط مسجل بشكل صارم ، مما يضمن بيانات مكانية وزمانية موثوقة. تتيح هذه التقنية الإثارة والكشف المتزامن عن أربع قنوات في مجهر متعدد الفوتون.

استخدام الألياف البلورية الضوئية لتوسيع النبضات ل SHG و THG و 2 و 3 فوتون. تلتقط SLAM معلومات إشارات الخلايا الهيكلية والديناميكية الأيضية متعددة الإرسال دون القطع الأثرية للمحاذاة أو الملصقات الخارجية ، مما يتيح تحليل الأنسجة الكمي الموحد. تمتد تطبيقاته إلى علم الأحياء الأساسي ، والبحوث الانتقالية ، واكتشاف المؤشرات الحيوية في علم الأورام ، والتنكس العصبي ، وتجديد الأنسجة.

للبدء ، استخدم مطياف أو محلل طيف بصري لقياس الليزر بعد المرآة المكافئة والتحقق من توليد الاستمرارية الفائقة للألياف البلورية الضوئية. قم بتدوير لوحة منتصف الطريق بعد مقسم الحزمة المستقطبة لتحسين عرض الاستمرارية الفائقة. قم بتشغيل الارتباط التلقائي للفحص المجهري.

في البرنامج ، اضبط الكاشف على الكاشف الداخلي واضبط نطاق المسح الضوئي على 5 بيكو ثانية لالتقاط العرض الكامل للارتباط الذاتي للنبض. قم بفك حظر الليزر وقم بمحاذاة الارتباط التلقائي مع الشعاع الخارج من مشكل النبض حتى تظهر إشارة. تأكد من إغلاق الغالق 2.

ثم ضع وسائط الغمر المناسبة ، مثل الماء أو الزيت ، على العدسة الموضوعية. ضع الكاشف الخارجي للارتباط الذاتي على مرحلة المجهر وضعه مباشرة فوق الهدف. الآن قم بتشغيل مرايا الجلفانومتر المسح لضبط جهدها على 0.

افتح الغالق واستخدم هدفا فلوريا للتأكد من وصول الشعاع إلى الكاشف الخارجي. اضبط كاشف الارتباط التلقائي ليكون الكاشف الخارجي. ثم اضبط موضع المسرح حتى تظهر الإشارة.

اضبط معاملات كثيرة الحدود لمشكل النبض لتقليل عرض النبضة المقاس بواسطة المرابط التلقائي بشكل متكرر. مع انخفاض عرض النبضة ، قم بتقليل نطاق المسح وفقا لذلك لتحسين دقة وتصور وظيفة الارتباط التلقائي. تأكد من حظر مدخلات الليزر إلى الألياف البلورية الضوئية وقم بتشغيل الليزر.

اترك الليزر يسخن لمدة 30 دقيقة. تحقق من خلو مسار الحزمة من العوائق ، ثم ضع مقياس طاقة ضوئية في مسار الحزمة قبل الألياف البلورية الضوئية مباشرة. اضغط على زر التحكم لفتح الغالق 1 وقياس طاقة الإدخال.

أغلق الغالق 1 مرة أخرى. انقل عداد الطاقة إلى إخراج الألياف البلورية الضوئية بعد المرآة المكافئة. افتح الغالق 1 واستخدم مرحلة الإدخال ثلاثية المحاور لزيادة طاقة الإخراج إلى أقصى حد.

دع الألياف البلورية الضوئية تسخن لمدة 10 دقائق ثم قم بزيادة طاقة الخرج مرة أخرى باستخدام المرحلة ثلاثية المحاور وسجل انتقال PCF. حرك مقياس الطاقة بعد مرشح الكثافة المحايدة وقم بتدوير الفلتر لضبط طاقة الليزر التي تصل إلى العينة. اضرب القدرة المقاسة في نفاذية البصريات المتبقية لتحديد قوة العينة.

الآن ، قم بتشغيل الجلفانومتر والمرحلة. قم بتشغيل برنامج الاستحواذ وأدخل معلمات التصوير المطلوبة. ضع العينة على المسرح باستخدام نفس وسائط الغمر التي تم تطبيقها سابقا على العدسة الموضوعية.

ثم أطفئ أضواء الغرفة وأغلق الستائر لمنع دخول الضوء المحيط. بعد ذلك ، قم بتشغيل مصادر طاقة الكاشف ومكبرات الصوت. أغلق صندوق الضوء المحيط بمرحلة المجهر.

استخدم مفاتيح التحكم الإلكترونية لفتح مصاريع الكاشف يدويا من 3 إلى 6. في برنامج الاستحواذ ، اضغط على خيار انقر لبدء الاستحواذ لبدء تصوير SLAM. اضبط تركيز المجهر باستخدام مقبض وحدة التحكم في المسرح حتى تصبح العينة مرئية بوضوح.

استخدم عصا التحكم الموجودة على وحدة التحكم في مرحلة المجهر للعثور على مجال الرؤية المطلوب. بمجرد تحديد الموضع ، انقر فوق إيقاف وإعادة تعيين. ضمن علامة التبويب حفظ، قم بتبديل حفظ البيانات إلى نعم.

ثم اضغط على خيار انقر لبدء الاستحواذ وانتظر حتى يكتمل التصوير. لمعالجة العينة أثناء التصوير ، أغلق مصاريع الكاشف واستخدم مصباحا يدويا أو مصباحا أماميا للإضاءة. بعد التعديلات، ارجع إلى إعداد التصوير.

لإنهاء الحصول على الصور ، أغلق مصاريع الكاشف ، وأطفئ أجهزة الكشف ، وعندها فقط قم بتشغيل أضواء الغرفة. قم بحظر الليزر باستخدام الغالق 1 ، ثم قم بإيقاف تشغيل الليزر. قم بإيقاف تشغيل الجلفانومتر والمرحلة وأغلق برنامج الاستحواذ.

تخلص من عينة الأنسجة بشكل مناسب ونظف محطة العمل. أظهرت الألياف البلورية الضوئية المشقوقة بشكل صحيح وجها مسطحا عموديا على محورها ووجها نظيفا. أظهرت الألياف البلورية الضوئية المشقوقة بشكل سيئ جروحا بزاوية ووجوه متكسرة وخدوش أو حطام واضح على السطح.

أدى التعامل غير السليم أو التلوث إلى تراكم الأوساخ والجسيمات المرئية حول سطح الألياف مما يحجب نمط ثقب الهواء. يشير اللب المحترق مع المناطق المظلمة إلى تلف الألياف البلورية الضوئية في نهاية عمرها الافتراضي. امتد طيف الاستمرارية الفائقة حوالي 975-1 ، 175 نانومتر مع قمة مسطحة وتعديلات طيفية مميزة.

أظهر الارتباط الذاتي للنبضة بعد الضغط مظهرا متماثلا مع نصف حد أقصى ضيق كامل العرض ، مما يشير إلى تشكيل نبض جيد. أنتجت مصادر الاستمرارية الفائقة التي تعمل بشكل صحيح إشارات توافقية قوية ثانية وثالثة. أدى الاستمرارية الفائقة الضيقة إلى فقدان شدة الإشارة التوافقية الثالثة مع الاحتفاظ بالإشارة التوافقية الثانية.

أدى عدم تشكيل النبض إلى تقليل جميع الإشارات غير الخطية بشكل كبير ، مما أدى إلى صورة باهتة ومنخفضة التباين. أظهر التصوير الناجح ل SLAM لأنسجة الكلى خارج الجسم الحي هياكل نيفرون مميزة مع إشارات بصرية قوية متعددة ، بما في ذلك الجيل التوافقي الثالث وتألق NADPH. يمكن التعرف على ألياف الكولاجين الخلالي الكلوي عبر إشارات التوليد التوافقي الثاني القوية.

أشارت صورة نسبة الأكسدة والاختزال إلى ارتفاع التمثيل الغذائي للميتوكوندريا الهوائي في الأنابيب القريبة من قشرة الكلى مقارنة بالنخاع. أكدت خريطة نسبة الأكسدة والاختزال الثانية التباين المكاني في التمثيل الغذائي المؤكسد ومحلل السكر ، مما يعزز استخدام الطاقة التفاضلية داخل الأنسجة.