إنتاج الخلايا البثنية المتوسطة المعتمدة على التثبيت المعتمدة على المفاعلات الدقيقة المهيأة لمتلازمة الضيق التنفسي الحاد

ندرس كيف تتفاعل الخلايا مع بيئتها، بما في ذلك عند إنتاج أو تصنيع الخلايا كعلاجات. هنا، نتناول أسئلة حول كيفية إنتاج الخلايا المعتمدة على التثبيت مثل الخلايا العضلية الميزانشيمية، أو الخلايا الجذعية، لتجاوز بعض الحواجز أمام الترجمة السريرية. تزايد الاعتراف بأن تباين أعداد الخلايا يؤثر على اتساق وفعالية المنتج النهائي لكل دفعة أو شخص.

يمكن أن تؤثر هذه التحديات حتى على الموافقة التنظيمية لبعض العلاجات الخلوية. نستهدف فجوة يمكنها تحقيق عدد كبير من الخلايا لكل ملليلتر من السائل عند تحكم عال في البيئة وبطريقة يمكن توسيعها. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتضمين المراقبة البيئية الخطية للخلايا التي تعتمد على التثبيت مثل الخلايا الميدانية الميدانية.

هذا التحكم في العملية ميزة مقارنة بالقوارير التي لا تزال تستخدم في معظم الإنتاج المخبري والسريري. هناك عدة أسئلة مفتوحة لخلايا MSC وأنواع الخلايا الأخرى الحساسة للإشارات الميكانيكية. على سبيل المثال، كيف يمكن لهذا النوع من النهج أن يساعد في هندسة الخلايا لمعالجة حالات الأمراض الأخرى؟

للبدء، قم بإزالة الغطاء البلاستيكي الشفاف المتصل بالزجاجة LL من رف الزجاجات. باستخدام حقنة جديدة معقمة بسعة 50 ملليلتر بدون مكبس، قم بتوصيل الفوهة بزجاجة LL. صب الماء المفلتر المعقم في برميل الحقنة وحقنها في الزجاجة LL. وبالمثل، املأ الزجاجة L ب 25 ملليلتر من DMEM منخفض الجلوكوز بدون FBS، والزجاجة R ب 25 ملليتر من PBS المعقم، وزجاجة RR بثمانية ملليتر من محلول الشطف المضاد للالتصاق. كرر العملية لتحضير العدد المطلوب من المواد الاستهلاكية للتجربة.

بعد ذلك، قم بإجراء اختبار ذاتي على كل وحدة ستستخدم في التجربة. بمجرد أن تجتاز الكبسولة جميع الفحوصات من الاختبار الذاتي، قم بإزالة أشرطة الاختبار الذاتي وضعها في أكياس تخزين محمية من الضوء. ركب المادة الاستهلاكية في المفاعل الحيوي.

أزل الشريط الأخضر من صمامات المواد الاستهلاكية، وركب المادة المستهلكة داخل الكبسولة. أعد تركيب المشابك وتحقق من وجود أي صوت صفير للتأكد من وجود ختم ثابت. قم بتوصيل خط حساس الضغط الأبيض، وخط ضغط الهواء الأحمر، وخط الفراغ الأزرق بين المادة الاستهلاكية ومحطة القاعدة أو الكبسولة.

تأكد من أن منفذ الحقن الجانبي مغلق بإحكام باستخدام مشبك دمعة أبيض قبل بدء تجربة جديدة. انقر على أيقونة Flush Bottles في واجهة البرنامج. قم بتفعيل زر الراديو للزجاجة L، ثم اختر خيار الإخراج إلى الهدر، ثم اضغط على بدء التدفق MSCserum.

في نافذة محتويات الزجاجة، أشار إلى أن MSCserum موجود في الزجاجة R، التي تحتوي على PBS. ثم انتقل إلى العمليات اليدوية ونفذ ثلاث دورات غسيل إخراج على زجاجة النفايات. في نافذة محتويات الزجاجة، أشار إلى أن MSCserum موجود الآن في زجاجة RR، التي تحتوي على محلول الغسيل المضاد للالتصاق.

ارجع إلى العمليات اليدوية وقم بدورة غسل إخراج واحدة على زجاجة النفايات. بعد 30 دقيقة، اشطف المادة المستهلكة باستخدام PBS. أفرغ المفاعل لانتظار حقن الخلية والحاملة الدقيقة.

في لوحة العمليات اليدوية اضغط على إعادة تلقيح. اترك النظام مؤقتا عند المرحلة التي تعرض فيها لوحة التحكم تنبيه لتطعيم المفاعل. بعد ذلك، قم بعمل ماصة حجم محسب من الخلايا المعلقة في أنبوب مخروطي بحجم 15 ملليلتر يحتوي على حاملات دقيقة لكل حالة.

املأ كل أنبوب إلى ما بين 2.2 و2.5 ملليلتر بوسائط خلايا جذعية متوسطة ودافئة من البشر المتوسطة. العمل مع مادة أو اثنتين من المواد الاستهلاكية في كل مرة، وأخرجها من المحطة الأساسية وأدخلها إلى خزانة السلامة البيولوجية. اسحب خليط الخلية والحاملة الصغيرة إلى حقنة سعة خمسة ملليلتر باستخدام إبرة خضراء بطول أربعة إنشات.

حقن الخليط في المفاعل. أمسك خط منفذ الحقن بالقرب من قاعدة الكاسيت مع الحذر حتى لا تفصل الخط. باستخدام حركة دحرجة بين الإبهام والسبابة، لف خط منفذ الحقن لدورتين كاملتين لخلق انحناء متعقد في الخط.

ضع العقدة في مساحة القطع بالقرب من قاعدة منفذ الحقن وثبتها بقطعة صغيرة من شريط المختبر. ثم أعد المادة الاستهلاكية إلى محطة القاعدة. بعد تكرار الحقن لجميع المواد الاستهلاكية، يمكنك التنقل عبر واجهة البرنامج للإشارة إلى اكتمال التطعيم.

عندما يعود البرنامج إلى الصفحة الرئيسية، قم بإزالة المشبك الأبيض من خطوط الإخراج الاستهلاكية. ادخل إلى العمليات اليدوية وقم بأداء وظيفة إخراج الفائض مع ضبط منفذ الإخراج على P للتدفق. تفعيل وضع المزج الثابت باستخدام دورة 1، 680 ثانية تشغيل و120 ثانية إيقاف، واضبط تردد المزج على خمسة هرتز.

لبدء جمع الخلايا، استخدم حقنة بسعة ملليلتر واحد لسحب 200 ميكرولتر من بروناز وحوالي 300 إلى 400 ميكرولتر من الهواء. افتح غطاء أنبوب الحقن الجانبي ورش موصل الصمام بدون إبر بنسبة 70٪ إيثانول. أزل الشريط من خط حقن المنفذ الجانبي المعقود، وفك العقدة، وفك مشبك القرص الأبيض المصنوع من قطرة الدموع.

الآن، وصل حقنة الميليتر الواحد واحقن بروناز بلطف في المفاعل. اتبع السائل بالهواء لضمان التوصيل الكامل. أعد تشغيل مشبك قطرة الدمعة وأعد إغلاق خط الحقن.

ثم أعد المادة الاستهلاكية إلى الكبسولة، وأعيد توصيل جميع الخطوط، وأزال المشبك الأبيض C واستأنف الخلط. ضع زجاجة النفايات وزجاجة مصدر الوسائط على الثلج. ابدأ مؤقتا لمدة خمس دقائق ودع البروناز يهضم الحاملات الدقيقة في المفاعل.

بعد خمس دقائق، تحقق من أن الحاملات الدقيقة قد تدهورت بالتحقق من غيابها في المفاعل. اجمع الخلايا بالدخول إلى Manual Ops، اضبط عدد الدورات إلى ثلاث، اختر منفذ الإخراج W للنفايات، وانقر على Eject Wash. بعد الانتهاء من دورات غسل القذف، انقل المادة الاستهلاكية إلى خزانة السلامة البيولوجية.

ثم اسحب محتويات زجاجة النفايات باستخدام حقنة بسعة 10 أو 20 ملليتر. قم بتوزيع محتويات زجاجة النفايات في أنبوب طرد مركزي مخروطي بسعة 15 ملليتر. قم بالطرد المركزي على الخلايا على 300 جرام لمدة خمس دقائق.

استنشق المادة الفائقة وقيم حجم حبيبات الخلية. تم الحفاظ على الظروف البيئية، بما في ذلك الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة والأكسجين المذاب، وثاني أكسيد الكربون، بشكل مستقر طوال فترة الزراعة التي استمرت 10 أيام في نظام المفاعل الميكروبيولوجي. كان التفاوت في درجة الحموضة أقل بشكل ملحوظ في المفاعل الميكروبيولوجي مقارنة بحالة قارورة البوليستيرين في زراعة الأنسجة.

كان إنتاج الخلية أعلى في المفاعل الحيوي الدقيقي مقارنة بقارورة T25 مع الحفاظ على قدرة خلوية مماثلة. من بين 14 سمة جودة حرجة مرتبطة بالقوة تم قياسها، أظهرت تسع منها تعبيرا أعلى بشكل ملحوظ في mRNA في حالة المفاعل الحيوي الميكروبي مقارنة بقارورة T75.