استكشاف تفاعلات البروتين والجليكان: التقدم في الرنين المغناطيسي النووي

نحن ندرس تفاعلات البروتين والبروتين والبروتين والجليكان ، مع التركيز على مركب الإنتجرين والتفكك. يستكشف نموذجنا الديناميكيات الهيكلية ويسلط الضوء على دور القوة السطحية في التوسط في التكوين المعقد واستقرار التفاعل. مجموعتنا مكرسة لدراسة دور القوى السطحية في التعرف الجزيئي وتطور مواقع الربط من خلال دراسة العناقيد السطحية الكارهة للماء الموجودة في البروتينات.

يتيح محلول الرنين المغناطيسي النووي اكتشاف تفاعلات البروتين. على الرغم من أن التفاعلات الضعيفة ضرورية للحياة ، إلا أن هناك تحيزا تجاه المجمعات عالية التقارب ، على الرغم من وجودها في العديد من الوظائف البيولوجية المهمة. تركز مجموعتنا على استخدام مناهج البيولوجيا الهيكلية التكاملية لدراسة مركب البروتين الكبير.

نحن نستخدم الرنين المغناطيسي النووي كأداة رئيسية لدراسة الديناميكيات والجوانب الوظيفية. للبدء ، قم بإعداد محلول أربعة ملليمولار من D-mannose في مخزن فوسفات الصوديوم عند درجة الحموضة 7.4 مع 50 ملليمولار كلوريد الصوديوم و 5٪ أكسيد الديوتيريوم. قسم المحلول إلى عينتين ، إحداهما تحتوي على 80 ميكرومولار CVN ، والثانية بدونه.

لرسم خرائط ارتباط الترابط من خلال اضطراب التحول الكيميائي على مطياف الرنين المغناطيسي النووي ، قم بإعداد تسلسل نبض HSQCTOPSI للحصول على H1C13 HSQC. قم بتكوين المجال الزمني والعرض الطيفي وتردد الموجة الحاملة وعدد عمليات الفحص. احسب اضطراب الانزياح الكيميائي باستخدام المعادلة المقدمة.

لتعيين ربط الترابط من خلال فرق نقل التشبع ، أولا ، قم بإنشاء مجموعة بيانات جديدة. قم بتكوين المعلمات لتجارب الرنين المغناطيسي النووي STD إما عن طريق فحص ترددات التشبع المختلفة أو تثبيت التردد مع تغيير أوقات التشبع لتقييم التراكم. قم بإعداد تجارب الرنين المغناطيسي النووي 1D H1 باستخدام تسلسل نبض ZGPR.

اضبط مطياف H1 ، وقم بإجراء الحشوة ، وقم بقياس نبضة صلبة بزاوية 90 درجة. قم بتوسيط تردد الموجة الحاملة عند 4.7 جزء في المليون تقريبا ، بما يتوافق مع إشارة الماء ، ثم حدد STDDIFFESGP. 3 تسلسل النبض وتعيين معلمات الاستحواذ.

اضبط العرض الطيفي كما هو مطلوب ، وقم بتأخير المسح البيني D1 إلى أربع ثوان ، وحدد وقت التشبع D20 ، وفقا لأهداف التجربة. قم بتحميل قائمة FQ2 بتردد الرنين عند 40 جزءا في المليون تحت الصفر وترددات الرنين لتشبع البروتين فقط. اختبر ترددات الرنين التي تبلغ سالب 0.59 و0.73 و8.1 جزء في المليون لتحديد الظروف المثلى.

استخدم التردد الأمثل للحصول على أطياف الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي في أوقات تشبع تبلغ 0.5 وواحد و1.5 واثنتين و2.5 وثلاث وأربع ثوان. ارسم قيم ASTD المقابلة كدالة لوقت التشبع. الآن ، اضبط عدد عمليات المسح على 64 وقم بمتوسط حلقة التجربة أربع مرات.

ثم احسب العدد الإجمالي لعمليات الفحص. اضبط تأخير المسح البيني على أربع ثوان ووقت الاكتساب على 2.7262976 ثانية. قم بتكوين نبضة التشبع عن طريق ضبط المدة على 50 مللي ثانية والتحكم في الشكل الغوسي عبر البرنامج على الشكل 9SP9.

قم بتطبيق مرشح صف T1 في متغير الرنين المغناطيسي النووي STD ، ثم اضبط وقت قفل الدوران D29 بناء على حجم البروتين. لتعيين ربط الترابط H1 R2 ، أولا ، حدد برنامج النبض CPMG_ESGP2D من مكتبة Bruker القياسية. قم بتعيين التجربة كعملية استحواذ ثنائية الأبعاد.

قم بتكوين معلمات الاكتساب كما هو موضح. بعد ذلك ، قم بإجراء التجربة لمدة 200 دورة من ثماني عمليات مسح لكل منها. اضبط قائمة عدادات المتغيرات وفقا للوقت الإجمالي المطلوب لدورة CPMG.

قم بإجراء تجربتين ، واحدة للعينة مع البروتين والأخرى لعينة الترابط فقط. ارسم أطياف H1 لكل TCPMG باستخدام الأمر EFP أو sine M متبوعا ب FP ، ثم اضبط وظيفة النافذة وفقا لأفضل استراتيجية معالجة. احسب حاصل CPMG Q باستخدام المعادلة.

احصل على H1N15HSQC طيف من CVN الذي يحمل علامة N15 عند 298 كلفن. معايرة D-مانوز للوصول إلى التركيزات النهائية التي تساوي صفر، واحدا، اثنان، خمسة، 10، 20، 40، 60 ملليمول. استخدم تسلسل نبض HSQC الحساس للطور FHSQCF3GPPH السريع من مكتبة Bruker القياسية.

ثم احسب اضطراب الانزياح الكيميائي باستخدام الصيغة. ارسم قيم CSP لكل بقايا كدالة لتركيز D-mannose لتحديد ثابت التأين KD باستخدام المعادلة الخامسة. بعد ذلك ، قم بتركيب البيانات الناتجة مع متساوي حرارة ربط واحد باستخدام الصيغة.

استخدم تسلسل النبض HSQCT2ETF3GPSI3D الحساس للطور وقم بتكوين المعلمات كما هو موضح لقياس قيم N15 R2 للمخلفات الفردية لمخلفات CVN في حالة عدم وجود 60 ملليمولار D-mannose عند 298 كلفن. قم بمعالجة الأطياف الزائفة ثلاثية الأبعاد باستخدام NMRPipe لتوليد أطياف شبيهة ب HSQC لكل تأخير في الاسترخاء. استيراد الأطياف المعالجة إلى منصة تحليل.

بعد ذلك ، حدد جميع الأطياف وقم بتطبيق أداة متابعة تغييرات الشدة. ارسم شدة كل قمة متقاطعة كدالة للاسترخاء T وتناسب الاضمحلال مع دالة أسية أحادية لاستخراج N15 R2 قيم لكل بقايا. احسب الخطأ التجريبي من نسبة الإشارة إلى الضوضاء للأطياف الشبيهة ب HSQC عند 67.84 مللي ثانية.

قم بمعالجة منطقة من الطيف تحتوي على ضوضاء فقط وقم بتحويلها إلى ملف نصي باستخدام الأمر المحدد. ثم حدد الانحراف المعياري لمنطقة الضوضاء أو شدة الضوضاء باستخدام البرامج الإحصائية. احسب الخطأ التجريبي باستخدام المعادلة المحددة.

لوحظت اضطرابات التحول الكيميائي لكلا الشكلين الشاذين من D-mannose في وجود CVN ، مع ظهور تحولات أكبر في beta-D-mannose ، مما يشير إلى الارتباط التفضيلي. لوحظت قمتان متميزتان لمعظم هيدروجينات D-mannose في وجود CVN ، والتي تتوافق مع الحالات الحرة والمقيمة. ارتبطت نوى الهيدروجين التي تظهر أعلى قيم ASTD ب beta-D-mannose ، بما يتفق مع التفاعلات ثنائية القطب القوية مع CVN.

في تحليل معدل الاسترخاء العرضي ، كان H beta four هو البروتون الوحيد الذي أظهر زيادة ملحوظة في الاسترخاء عند الارتباط ب CVN. كانت اضطرابات التحول الكيميائي H1 و N15 الناتجة عن إضافة الترابط أعلى عند تركيز يصل إلى 10 ملليمولار. أظهرت البقايا I40 و E41 و N42 و V43 و D44 و G45 داخل خيط بيتا اضطرابات تحول كيميائية كبيرة ، وحددتها على أنها موقع ربط عالي التقارب ل D-mannose.

أظهرت متساوي الحرارة الملزمة أن البقايا D44 لها أعلى تقارب بين بقايا خيوط بيتا ، مع ثابت تفكك يبلغ حوالي مللي مولار. أظهر قياس معدلات الاسترخاء N15 R2 زيادات وانخفاضات في قيم دلتا R2 عند ربط D-mannose ، مما يشير إلى مزيج من عمليات التثبيت والتبادل التوافقية. أظهرت البقايا C58 و R59 و K74 و R76 زيادة في قيم دلتا R2 ، مما يؤكد مشاركتها في موقع الارتباط عالي التقارب ، بينما مثلت المخلفات F4 و C8 و R24 و G27 منطقة التقارب المنخفض.