تعزيز تقنية مستقبلات المستضد الخيمري - الحويصلات خارج الخلية (CAR-EV): مستقبل علاج السرطان

يركز بحثنا على تطوير التشخيص والعلاجات القائمة على الإكزوسوم. الهدف هو تطوير علاجات قائمة على الإكزوسوم لمستقبلات المستضد الخيمري ، والتي تكون أكثر أمانا وفعالية ويمكن الوصول إليها من العلاجات القائمة على الخلايا ، لعلاج الأورام الجانبية. تتيح منصات EXO-NET و EXO-ACE الخاصة بنا عزلا إكسوسوميا قابلا للتطوير وقابلا للتكرار ومتوافقا مع GMP مع إنتاجية ونقاء عاليين ، مما يعالج قيود الطرق التقليدية للبحث والعلاجات.

يتيح EXO_NET net و EXO-ACE عزل EV سريع وقابل للتطوير ومتوافق مع GMP ، مع نقاء وقابلية استنساخ فائقة ، ويتفوق على الطرد المركزي وهطول الأمطار للبحث والتشخيص والتطبيقات العلاجية. لقد طورنا طريقة سريعة وقابلة للتطوير والتحقق من صحتها لهندسة المركبات الكهربائية والمركبات الكهربائية ، وتقديم علاجات مستهدفة من الجيل التالي وخالية من الخلايا. يوفر هذا سير عمل قويا يمكن تطبيقه على حالات المرض الأخرى حيث توجد حاجة سريرية.

هدفنا التالي هو استخدام الأساليب التي طورناها والتحقق من صحتها لتوليد CAR-EVs لتقديم علاجات الحمض النووي الريبي لعلاج الأورام الصلبة والأمراض الالتهابية الأخرى. للبدء ، قم بإحضار عمود التبادل الأيوني إلى درجة حرارة الغرفة عن طريق السماح له بالوقوف في وضع مستقيم لمدة 15 دقيقة. باستخدام ماصة، أضف 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للتجديد، متبوعا ب 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للتوازن.

قم بتمرير الوسط المكيف THOD عبر مرشح بولي إيثر سلفون 0.22 ميكرومتر. الآن ، أضف ما يصل إلى 31.2 وحدة تخزين أعمدة من العينة التي تمت تصفيتها إلى العمود المتوازن. ثم أضف 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للغسيل ، متبوعا ب 2.5 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للشطف.

اجمع التدفق من خلال احتواء الحويصلات المخصبة خارج الخلية. باستخدام مرشحات الطرد المركزي للترشيح الفائق 30 كيلو دالتون ومخفف ، قم بإجراء تبادل عازلة على الحويصلة خارج الخلية ، مما يضمن تخفيفا لا يقل عن 100 ضعف. اضبط الحجم النهائي للحل المتبادل بناء على الاحتياجات التجريبية.

قم بتمرير عينة الحويصلة المخصبة خارج الخلية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لتعقيمها للمقايسات في المختبر. تحديد حجم توزيع وتركيز وإنتاجية حويصلات CAR خارج الخلية باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية. لعزل الحويصلة خارج الخلية عالية الإنتاجية ، قم بتشغيل الجهاز وتسجيل الدخول إليه.

قم بتكوين الإعدادات لإنشاء بروتوكول عزل بروتين HT EV. قم بإعداد طبق مشط طرف عن طريق وضع مشط طرف في طبق بئر عميق 96 بئرا. أضف مليلترا واحدا من PBS في كل بئر لتحضير ثلاثة أطباق غسيل.

الآن ، قم بإعداد لوحة شطف عن طريق سحب 35 ميكرولتر من 1٪ SDS في كل بئر من لوحة 96 بئرا. ثم قم بإعداد لوحة ربط بإضافة مليلتر واحد من الوسط المكيف. في نظام العزل الآلي ، ابدأ البروتوكول بتحديد البرنامج HT EV Protein Isolation Protocol ، وحدد زر التشغيل.

افتح الجهاز لبدء تحميل الألواح. اتبع تعليمات الجهاز وقم بتحميل ألواح الشطف المحضرة ، متبوعة بألواح الآبار العميقة ثلاثية الغسيل في الجهاز. قبل تحميل لوحة الربط مباشرة ، أضف 30 ميكرولتر من حبات التقاط عموم الإكزوسوم في كل بئر.

قم بتحميل لوحة الربط في الأداة ، ثم قم بتحميل لوحة مشط الطرف ، وأغلق الجهاز لبدء الربط. سيقوم النظام بخلط العينة المتوسطة المكيفة والخرز المغناطيسي بشكل مستمر بسرعة بطيئة لمدة 30 دقيقة ، مما يسهل الالتقاط الفعال للحويصلات خارج الخلية. عند الانتهاء من خطوة الربط ، اسمح للنظام بتنفيذ ثلاث خطوات غسيل ، والخلط بسرعة بطيئة لمدة 30 ثانية لإزالة الملوثات غير المحددة.

اسمح للنظام الآلي ببدء تحلل الحويصلة خارج الخلية لاستعادة البروتين عن طريق إجراء مزيج سفلي مدته 30 ثانية. أثناء الحضانة، ستتوقف الأداة مؤقتا لمدة سبع دقائق و30 ثانية، مع إبقاء أطراف الماصة موضوعة فوق كل بئر. ابدأ مزيجا آخر لمدة 30 = ثانية ، متبوعا بتوقف مؤقت آخر لمدة سبع دقائق و 30 ثانية.

عند انتهاء البروتوكول ، سيرفع النظام مشط الطرف المستخدم ، تاركا المحلول في لوحة 96 بئرا والخرز المغناطيسي المرفق بالأطراف. أخيرا ، ستنتقل الأداة إلى خطوة المغادرة ، وتعيد مشط الطرف إلى لوحة مشط الطرف. افتح الجهاز وقم بإزالة اللوحات.

أكد مضان GFP تعبير CAR في الخلايا التائية المنقولة ، مع توطين واضح في مجموعات الخلايا ، والتحقق من التوطين المشترك عن طريق تراكب قنوات الحقل الساطع و GFP. كشف تحليل تتبع الجسيمات النانوية عن تركيز أعلى بكثير من الحويصلات خارج الخلية في جزء EV المخصب مقارنة بالوسائط المكيفة لكل من تركيبات EGFR و HER2 CAR. أكد النشاف الغربي وجود جرانزيم ب في الخلايا التي تعبر عن CAR وفي الحويصلات المعزولة خارج الخلية ، مع غياب الكالنيكسين في الحويصلات خارج الخلية ، مما يشير إلى نقص التلوث الخلوي.

قللت الحويصلات خارج الخلية CAR التي تستهدف EGFR بشكل كبير من صلاحية خلايا سرطان الثدي MCF-7 بنسبة 70٪ ، وأظهرت قابلية خلايا سرطان الدم K-562 بنسبة 40٪ ، حيث تستهدف HER2 ، أظهرت الحويصلات خارج الخلية في السيارة انخفاضا بنسبة 10٪ في بقاء خلايا سرطان الثدي MCF-7 ، بينما ليس لها تأثير ملحوظ على خلايا سرطان الدم K-562.