إعادة برمجة الخلايا السرطانية القابلة للتتبع في الجسم الحي إلى الخلايا الشبيهة بالخلايا المتغصنة التقليدية من النوع 1

نحن نبحث في البرمجة في الجسم الحي للخلايا السرطانية في خلايا شبيهة ب cDC1 كاستراتيجية علاج مناعي جديدة. نحن نهدف إلى تحديد ما إذا كان هذا النهج يمكن أن يحول أورام البرد المناعية إلى مناعة ساخنة ، وبالتالي الإعلان عن مناعة مضادة للورم. نحن نعالج قيود استراتيجيات توليد cDC1 الحالية في الجسم الحي من خلال تقديم بروتوكول لتحويل الخلايا السرطانية إلى خلايا مناعية شبيهة ب cDC1 مباشرة داخل الورم ، مما يتيح دراسة الاستجابات المناعية التي تحركها cDC1 في الموقع.

يولد بروتوكول البرمجة القابل للتتبع في الجسم الحي بشكل موثوق خلايا مناعية ناضجة شبيهة ب cDC1 ، والتغلب على البيئة الدقيقة للورم القمعية ، ولأن هذه الخلايا تتولد مباشرة في الجسم الحي ، فإن هذا النهج يلغي الحاجة إلى تصنيع الخلايا المناعية في المختبر. تضع النتائج التي توصلنا إليها أساسا لترجمة إعادة البرمجة بوساطة عامل النسخ في الجسم الحي إلى العيادة ، وتقديم العلاج المناعي الجاهز للسرطان ، ولكن الشخصي الذي يثير استجابات مناعية دائمة مضادة للأورام. من الآن فصاعدا ، نبحث في كيف يمكن لإعادة برمجة الخلايا الشبيهة ب cDC1 أن تؤدي إلى تكوين المصادر الثالثية والبنية التحتية وما إذا كان هذا يترجم إلى مناعة خلطية.

بالإضافة إلى ذلك ، نحن نستكشف أيضا تآزرها المحتمل مع مناهج العلاج المناعي الأخرى. للبدء ، قم بزراعة خلايا HEK 293T حتى تصل إلى 70 إلى 80٪ من التقاء التقاء. الآن ، قم بدوامة مزيج التعداء المحضر الذي يحتوي على البلازميد المنقول جيدا لمدة دقيقة واحدة واحتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح بتكوين مركب دهون الحمض النووي.

استنشق الوسط من خلايا HEK 293T وأضف 10 ملليلتر من DMEM بدون البنسلين ستربتومايسين ومكمل ب 10٪ FBS. بعد ذلك ، أضف مزيج التعداء باتجاه تنقيط إلى ألواح 150 ملم واحتضن لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، استبدل الوسط ب 20 مل من الوسط الكامل DMEM المكمل بملليمولار واحد من زبدات الصوديوم ، واحتضن الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد ذلك ، اجمع المادة الطافية المحتوية على الفيروس العدسي في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر بعد 48 و 60 ساعة من التنفغ. بعد المجموعة الأولى ، أضف 12 مل من DMEM الكامل المسخن مسبقا لكل صفيحة 150 ملم للحصاد الثاني. قم بتصفية السائل الذي تم جمعه من خلال مرشح بولي إيثر سلفون منخفض البروتين 0.45 ميكرومتر.

ماصة 37 جراما من الوسط المحتوي على الفيروس العدسي في أنابيب بولي بروبيلين رقيقة الجدار 38.5 مليلتر. قم بالطرد المركزي للأنابيب في دوار دلو متأرجح عند 25 ، 000 جم لمدة 90 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، استنشاق المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.

ضع أنابيب البولي بروبيلين ذات الجدار الرفيع المفتوحة رأسا على عقب على منديل معملي أو مادة ماصة مماثلة لمدة خمس دقائق لتصريف السوائل الزائدة وتجفيف الحبيبات. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من DMEM المثلج البارد المكمل ب HEPES أو PBS إلى كل حبيبات وانقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يوضع في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. احتضن الحبيبات طوال الليل عند أربع درجات مئوية للسماح بإعادة التعليق الكامل.

اجمع جميع الكريات المعلقة في وعاء واحد ، وقم بتقسيم المخزون الفيروسي إلى أحجام أصغر تتراوح بين 50 و 200 ميكرولتر ، وتخزينها في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر للاستخدام طويل الأمد. بعد تمدد الخلايا السرطانية ، قم بإعداد معلقات الخلية للنقل لتحقيق نسبة شبه واحد إلى واحد من الخلايا الإيجابية إلى الخلايا السالبة EGFP في اليوم الثالث. أضف ثمانية ميكروغرامات لكل مليلتر من البوليبرين إلى تعليق الخلية ، متبوعا بالحجم المناسب من الفيروس العدسي ، كما هو محدد سابقا.

امزج المحتويات برفق دون توليد فقاعات. الآن ، قم بسحب ملليلترين من معلق الخلية المحضر الذي يحتوي على واحد في 10 لقوة خمس خلايا في كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة ذات الستة آبار واحتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الوسط المحتوي على فيروس العدس من كل بئر.

اغسل الآبار مرتين باستخدام PBS. أضف 500 ميكرولتر من التربسين إلى كل بئر واحتضن لمدة خمس إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، افحص الآبار تحت المجهر الضوئي لتأكيد انفصال الخلية بالكامل عن اللوحة.

بعد ذلك ، اجمع الخلايا باستخدام وسائط كاملة في أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلترا. قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة خمس دقائق عند 350 جم لحبيباتها. اغسل الحبيبات باستخدام PBS.

خذ حصة وقم بتقييم عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الخلايا الدموية والتلوين الأزرق التربية. بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية النهائية في PBS البارد لتحقيق تركيز من اثنين إلى أربعة في 10 لقوة سبع خلايا لكل مليلتر ، أي ما يعادل واحدا إلى اثنين في 10 لقوة ست خلايا في 50 ميكرولتر لكل ورم. ضع الخلايا على الجليد وانتقل إلى منطقة التجارب الحيوانية.

بعد تخدير الماوس CD45.1 ، ضعه على وسادة تدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم. ضع كريم العين على الفأر لمنع جفاف العين أثناء التخدير. باستخدام ماكينة حلاقة ، احلق الجانب الأيمن من الماوس.

اختياريا ، ضع علامة على الماوس بمقص أذن. تطهير المنطقة المحلوقة وإزالة الشعر المتبقي باستخدام مسحة مغموسة بنسبة 70٪. الآن ، باستخدام ماصة P1000 ، أعد تعليق الخلايا السرطانية تماما.

قم بتحميل تعليق الخلية المعلق بالكامل في حقنة سعة 0.5 ملليلتر مزودة بإبرة قياس 30. ارفع الجلد برفق على الجانب المحلوق من الفأر باستخدام إصبعين وأدخل طرف إبرة المحقنة في التجعد الذي يتكون من الجلد المرفوع. حرر الجلد المرفوع أثناء تثبيت المحقنة في مكانها بيد واحدة.

استخدم اليد الأخرى لتمديد الجزء العلوي من الجلد بإصبعين. قم بحقن 50 ميكرولتر ببطء من تعليق الخلية السرطانية لخلق تورم بيضاوي الشكل مرئي تحت الجلد في موقع الحقن. بعد إجراء الحقن ، راقب حتى يستيقظ تماما من التخدير لضمان البقاء على قيد الحياة.

أظهرت خلايا HEK 293T المنقولة باستخدام بلازميد SFFV-PIB-eGFP تعبيرا واضحا عن eGFP بعد 24 ساعة من التعداء ، مما يؤكد تسليم البلازما الناجح. بعد 72 ساعة من التحويل ، أشارت خلايا الورم الميلانيني إلى التسليم الناجح لعوامل إعادة البرمجة و eGFP. في اليوم التاسع بعد زرع الخلايا ، أسفرت إعادة البرمجة في الجسم الحي عن نسبة أعلى من الخلايا المعاد برمجتها بالكامل إيجابية CD45 ، ومتوافق كبير الكبير - II ، والخلايا الشبيهة ب cDC1 مقارنة بالظروف المختبرية.

في اليوم الثالث بعد الزرع ، أظهرت أورام PIB-eGFP تسلل الخلايا المناعية الإيجابية CD45 أعلى بشكل ملحوظ من عناصر التحكم في eGFP ، مما يشير إلى إعادة تشكيل المناعة المبكرة. بحلول اليوم التاسع ، ظل متوسط شدة التألق CD45 لكل منطقة ورم أعلى بشكل ملحوظ في أورام PIB-eGFP مقارنة بالضوابط. أصبحت الهياكل اللمفاوية الثلاثية قابلة للاكتشاف في أورام PIB-eGFP بحلول اليوم التاسع ، مما يشير إلى تغيرات مناعية هيكلية في البيئة المكروية للورم.