تطوير الخطوط العضوية المشتقة من الفئران من الخلايا الظهارية لقناة فالوب لنمذجة سرطان المبيض المصلي عالي الجودة

نعم، نحن نعمل حاليا على تطوير نماذج جديدة لسرطان المبيض المصلي عالي الدرجة، وهي نماذج متزامنة بمعنى ما يوضحه البروتوكول. نأخذ قناتي فالوب السليمة من فئران سليمة ثم نشتقها كعضويات في طبق بتري، ثم نعطيها جميع الأخطاء أو التعديلات الجينية المختلفة التي عادة ما نجدها في النسخة البشرية الطبيعية من المرض. هذا أمر رائع جدا لأنه من جهة، يمكنك دراسة جميع أنواع العوامل الجوهرية لهذه الأورام داخل طبق بتتري كعضويات، وهي أكثر واقعية من الثقافات ثنائية الأبعاد التقليدية.

لكن الأمر هو أنه بما أن هناك نماذج تركيبية، يمكنك بعد ذلك أخذ هذه الأعضاء ثم إعادتها إلى فأر، ثم ترى كيف يتطور الورم فعليا ويتفاعل مع المضيف. هذا يسمح لنا برؤية أكثر شمولية لكيفية حدوث الورم وتكوين الأورام فعليا، ونأمل أن يمنحنا ذلك أدوات أفضل وفهما أفضل لكيفية عمل هذا المرض وكيفية محاربته بشكل أفضل. للبدء، احصل على فئران C57 سوداء 6J أنثى تم إعدامها رحيما.

قم بإزالة المبيض وقناة فالوب وانقلهما إلى طبق بتري معقم يحتوي على DMEM، مع إضافة البنسلين ستريبتوميسين عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. استخدم مجهر تشريح، وملاقط دقيقة ومقص لإزالة الدهون المتبقية من المبيض. عزل قناة فالوب، بما في ذلك الداخل وجزء من الأمبولة البعيدة عن المبيض والرحم.

الآن انقل النسيج المنظف إلى أنبوب يحتوي على خليط الهضم الكامل. باستخدام مقص ناعم، قم بتقطيع قناة فالوب إلى قطع أصغر من 0.5 مليمتر. ثم حضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 40 إلى 50 دقيقة قبل إجراء الزراعة العضوية.

لتطوير نموذج ورم الفأر، تم إعداد خمس حقن، كل منها يحتوي على أربعة ملايين خلية معلقة في مصفوفة غشاء القاعدة الباردة كالثلج بدون مكملات Opti-MEM I. لتحضير الحقن، يجب أولا طرد فقاعات الهواء من الحجم الميت لحقنة الأنسولين U-100 المزودة بإبرة قياس 28 باستخدام PBS البارد. ثم قم بتحميل الحقنة ببطء ب 40 ميكرولتر من الخلايا واحتفظ بالحقن المحملة على الثلج حتى يتم تخدير الفئران.

بمجرد أن تكون جاهزة للحقن، ضع الحقن بجانب مصباح تسخين للسماح لمصفوفة الغشاء القاعدي بتسخين وزيادة اللزوجة، مما يساعد في الحقن والتركيب. بعد ذلك، ضع فأرا في قفص دافئ مسبقا تحت مصباح تسخين للتحضير للجراحة. قم بعمل شق أقل من سنتيمتر واحد على الجانب، فوق فخذ فأر مخدر.

اقطع عبر البشرة وتحت الجلد لتصل إلى منطقة الجراب. اسحب المبيض بلطف عن طريق تحديد موقع وسادة الدهون المرفقة. ثم باستخدام حقنة جاهزة، أحقن الخلايا عبر وسادة الدهون والمبيض في كيس قناة البيض.

أعد المبيض بحذر إلى الجراية. أغلق طبقة العضلات باستخدام خياطات غير مضفرة. بعد ذلك، أغلق الشق الجلدي باستخدام دبابيس جراحية.

أعد الفأر إلى القفص الدافئ وحافظ على درجة حرارة الجسم باستخدام مصباح تسخين حتى يصبح شبه واع، عادة لأكثر من 15 دقيقة. العضويات المشتقة من ظهارة قناتي فالوب في الفأر لها شكل كروي واضح وواضح بعد حوالي خمسة أيام وتحتاج إلى تغليف في اليوم العاشر إلى الثاني عشر. يتم تحويل العضويات البرية إلى أورام ما قبل السرطانية باستخدام تقنيات الهندسة الوراثية، مثل الإفراط في التعبير عن جينات الفيروسات العدسية أو الفيروسات الرجعية.

يمكن دراسة خطوط الخلايا المستنسخة المفردة المشتقة من العضوية المعدلة وراثيا بشكل أكبر في الجسم الحي عن طريق الحقن في الجرافة المبيضية. عادة ما يصل حجم الأورام إلى سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات بعد حوالي 60 يوما من الحقن. حسنا، نقول إنه كما أشرت سابقا، أن أكبر ميزة في طريقة عمل هذا البروتوكول هي توليد هذه النماذج التركيبية، أليس كذلك؟

وبما أنها متزامنة، كما قلت سابقا، يمكنك حقا تقدير التفاعل الكامل بين، كما تعلم، حيوان كامل، وفأر كامل، والورم الذي تطوره مع السيطرة الكاملة على جينات الورم. وبالطبع، بالمقارنة مع النماذج الأخرى حيث ربما تحاول فهم الجهاز المناعي داخل طبق بتري، سيكون من الصعب جدا تكرار جهاز المناعة في طبق بتري. أو إذا أخذت عينات من أورام المرضى ثم توضع في الفئران، لكي يعمل ذلك، لا يمكن للفئران أن تمتلك جهاز مناعي وإلا سيرفض هذا الورم، أليس كذلك؟

ولكن بما أن هذا النموذج مركب الجين، يمكنك حقا تقدير التفاعل الكامل بين المضيف كله والورم وخاصة مع الجهاز المناعي، الذي يعد حاليا من أكثر مجالات البحث سخونة في هذا المجال. لذا أعتقد حقا أن هذه هي أهم فائدة لهذا البروتوكول مقارنة بالبروتوكولات الأخرى التي تجدها في أماكن أخرى. في الواقع، كنا نستخدم هذه النماذج بالفعل للتحقيق في بعض الظواهر المثيرة للاهتمام.

أود أن أقول إن أكثر شيء يثير اهتمامي الآن هو كيف أن جهاز المناعة التكيفي، مما رأيناه، يبدو أنه يساهم بشكل رئيسي في تشكيل الخصائص الجينومية، خصوصا التغيرات في أعداد النسخ لسرطانات المبيض المصلية عالية الدرجة بمعنى أنه إذا لم يكن الجهاز المناعي موجودا، يبدو أن هذه الأورام لا تتطور فعليا مثل هذه التعديلات الضخمة والمعقدة في الحمض النووي. لذا نحاول معرفة كيف يحدث هذا وكيف يمكننا بعد ذلك أن نحاول تغييره لتعزيز أي نوع من العلاجات المناعية ضده.