التحسين السريع لنظام محفز للضوء للتحكم في التعبير الجيني للثدييات

يهدف هذا المشروع إلى تطوير طريقة عالية الإنتاج لتحسين وتوصيف أداة بصرية متعددة المكونات تسمى LACE لتعبير جينات الثدييات. للبدء، ضع قارورة زراعة الخلايا تحتوي على خلايا HEK 293 T داخل خزانة أمان حيوي. استخدم ماصة مصلية لاستنشاق الوسط المستهلك.

قم بمزج 10 ملليلتر من DPBS إلى زاوية واحدة من القارورة وقم بتدوير الزيوت بلطف لغسل الخلايا. ثم استنشق محلول الغسيل وتخلص من DPBS والشفط في حاوية النفايات. الآن أضف 1.5 ملليلتر من 0.05٪ تريبسين-إيدتا إلى القارورة لتغطية السطح، واحتضن.

انقر بلطف على القارورة لتخفيف الخلايا عن السطح. بعد ذلك، استخدم الماصة 8.5 ملليلتر من DMEM الطازج في القارورة. استنشق المحلول للأعلى والأسفل حتى لا تظهر أي تجمعات لإعادة تعليق الخلايا.

ثم نقل تسعة ملليتر من تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بسعة 15 ملليتر. أضف تسعة ملليتر من DMEM الطازج إلى القارورة. حضن التعليق حتى يلتقي تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية.

الآن، اخلط 10 ميكرولترات من الخلايا المعلقة مع 10 ميكرولترات من صبغة التربسين بنسبة واحد إلى واحد لحساب تركيز الخلايا باستخدام جهاز قياس الدم. تم زرع حوالي 35,000 خلية في 100 ميكرولتر في كل بئر من صفيحة زجاجية ذات رقم 1.5 أسود، بئر 96 بئرا وقاع زجاجي. ضع اللوحة في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.

للنقل، أولا أضف 11 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل الدافئ إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليلتر لبئر واحد و10٪ فائض. تحضير نسب كتلة البلازميدات المختلفة من البروتين الفلوري الأخضر المعزز ب CRY2 إلى RNA/Aliquot المرشد CIBN بمقدار 110 نانوجرام لكل بئر من المحاليل المحضرة في كل أنبوب يحتوي على الوسط الخالي من المصل. ثم قم بعمل 11 ميكرولتر إضافية من DMEM الخالي من المصل لكل بئر في أنابيب منفصلة لتخفيف كاشاف التحويل.

أضف مادة التحويل المخفف إلى خليط وسط الحمض النووي وحضن لتشكيل مركبات النقل. ثم يتم قذف 20 ميكرولتر من مركب النقل المحضر إلى كل بئر من صفيحة 96 بئر تحتوي على خلايا HEK 293 T بإبرة. لف لوحة ال 96 بئرا بورق ألمنيوم وضعها في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.

لبدء عملية التفعيل، قم بتعديل رمز إدخال المتحكم الدقيق لإضاءة الآبار المطلوبة باستخدام خطوط السكربت المحددة. اضبط شدة الصمام الثنائي الباعث للضوء إلى 9.27 ميلي واط لكل سنتيمتر مربع باستخدام خطوط الرمز المشار إليها. اضبط طول النبضة إلى ثانية واحدة، ثم اضبط تردد النبضة على 0.067 هرتز، أي ما يعادل كل 15 ثانية.

رش غطاء اللوحة البصرية المطبوعة ثلاثية الأبعاد بنسبة 70٪ إيثانول. ثم دعه يجف في خزانة السلامة البيولوجية. الآن، شغل مصباح ضوء أحمر في غرفة التحميض.

ضع لوحة 96 بئر في خزانة السلامة البيولوجية. استبدل غطاء اللوحة بالغطاء المجفف المطبوع ثلاثي الأبعاد. ضع لوحة ال 96 بئر على مصفوفة LED لتجميع جهاز التفعيل.

ضع جهاز مصفوفة LED المجمع بالكامل في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. قم بتوصيل المتحكم الدقيق، والصمام الثنائي الباعث للضوء، ومنافذ المروحة بمصدر طاقة. لإجراء قياس تدفق التومومترية، قم بتشغيل برنامج بدء تشغيل النظام على برنامج خبير الموقع.

حمل ملليترين من الماء منزوع الأيونات في محمل العينات. قم بتشغيل مراقبة الجودة باستخدام خرز مراقبة الجودة المقدمة. قم بإعداد وتحديد آبار العينات للاقتناء.

أنشئ المخططات والجداول الخاصة بالتشتت الجانبي مقابل التشتت الأمامي، ارتفاع التشتت الجانبي مقابل منطقة التشتت الجانبي، منطقة التشتت الجانبي مقابل FITC-A، وجدول إحصائيات FITC-A. الآن، قم بتثبيت لوحة V-bottom 960 في محمل الصفائح في جهاز قياس السايتومتر. اختر بئر غير محول وانقر على التهيئة (Initialize)، ثم زر التشغيل.

اضبط التشتت الجانبي وفولتية FITC لتمركز السكان المعنيين على مخطط SSC-A مقابل FSC-A. انقر على التشغيل، ثم اختر بروتين فلوري أخضر معزز ب CMV تم تحويله جيدا. اضبط جهد FITC ليشمل كل من الخلايا الفلورية الذاتية والخلايا الفلورية في مخطط SSC-A مقابل FITC-A.

أنشئ مضلعا لتقييد عدد الخلايا السليمة. مضلع ثان لبوابة لتمييز المزدوج على مخطط SSC-H مقابل SSC-A. أنشئ بوابة مضلعة لتمييز الخلايا المتوهجة عن غير المتوهجة باستخدام البوابة من الخلايا غير المنقولة كمرجع.

سجل العينات تلقائيا بسرعة 60 ميكرولتر في الدقيقة حتى تمر 200 ثانية أو يتم الوصول إلى 10,000 حدث. ثم تصدير متوسط قيم FITC كملف CSV وتحليل البيانات. نظف جهاز قياس التدفق الخلوي باختيار خيار التنظيف اليومي.

أظهر التصوير الفلوري أنه عند نسبة كتلة واحدة إلى تسعة، فإن تنشيط الضوء الأزرق أدى إلى انخفاض في أقصى تعبير ل eGFP مقارنة بنسبة خمسة إلى خمسة، والتي أظهرت أيضا زيادة في التسرب في الحالة المظلمة. أظهرت قياس تدفق الخلايا أن أكثر من 95٪ من الأحداث المحصورة في P1 كانت تقطعات منفردة عبر جميع الظروف. وكانت الخلايا غير المترجمة أقل من 0.1٪ من السكان الإيجابيين ل eGFP.

كان لدى الخلايا الضابطة ل CMV-eGFP حوالي 99٪ خلايا إيجابية ل eGFP، بينما الخلايا التي تم تحويلها ل 2pLACE كانت تحتوي على حوالي 57٪. أظهرت الخلايا المنقولة بواسطة CMV-eGFP تعبيرا قويا لل eGFP في ظروف الضوء والظلام، بينما لم تظهر الخلايا غير المنقولة أي تألق مرئي للتألق. كما أكد التحليل نجاحا في نقل 2pLACE وتنشيط تعبير eGFP تحت الضوء الأزرق مع تعبير أقل من CMVeGFP. لوحظت زيادة ثلاثية في تعبير eGFP في عينات 2pLACE المنشطة بالضوء مقارنة بالظروف المظلمة.

كانت نسبة الخلايا الموجبة ل eGFP في العينات التي تم تحويلها ل 2pLACE حوالي 60٪. حيث أنتجت نسبة الكتلة من ثلاثة إلى سبعة أعلى متوسط شدة فلورية ونطاق ديناميكي. يتيح هذا البروتوكول تقييم عالي الإنتاجية للعينات والتكرار التقني باستخدام optoPlate لبرمجة ظروف الضوء المختلفة وترددات النبضات.