تحفيز الخلايا البطانية الوعائية باستخدام مصائد العدلات خارج الخلية في وجود البروتين الدهني منخفض الكثافة

تشارك مصائد العدلات خارج الخلية في مجموعة متنوعة من الأمراض ، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، فإن التأثيرات التآزرية لتكوين NET والبروتينات الدهنية على خلايا الأوعية الدموية لا تزال غير واضحة. باستخدام هذا البروتوكول ، يستمر التحليل الميكانيكي حتى هذا التاريخ لكيفية تحفيز الاستجابات الالتهابية في الخلايا البطانية الأبهرية البشرية المعالجة بمصائد العدلات خارج الخلية والبروتين الدهني منخفض الكثافة.

لقد أثبتنا أن البروتين الدهني عالي الكثافة يعمل كمثبط لتكوين NET. يتم تعزيز ذلك عن طريق البروتين الدهني المؤكسد منخفض الكثافة ، والفوسفوليبيدات المؤكسدة ، والليزوفوسفوليبيدات. للبدء ، يتم الحصول على جهاز طرد مركزي من 45 إلى 50 ملليلترا من الدم البشري الكامل في أنبوب الهيبارين عند 700 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

قلل سرعة جهاز الطرد المركزي ببطء بعد الدوران ، ثم اجمع الطبقة العليا التي تحتوي على جزء البلازما. قم بالطرد المركزي لجزء البلازما مرتين عند 700 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية لإزالة خلايا الدم تماما ، مع الحفاظ على نفس إعداد التباطؤ. ثم أضف ميكرولتر واحد من محلول EDTA سعة 250 ملليمولار لكل مليلتر واحد من البلازما لمنع أكسدة البروتينات الدهنية بوساطة أيونات المعدن ثنائي التكافؤ.

ضع 2.7 مل من البلازما في أنبوب الطرد المركزي الفائق. تراكب ب 900 ميكرولتر من PBS يحتوي على 250 ميكرومولار EDTA. ثم قم بالطرد المركزي الفائق للأنبوب عند 600،000 جم لمدة سبع دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، تخلص من 900 ميكرولتر من الطبقة العليا للتخلص من جزء الكيلوميكرون. أضف 900 ميكرولتر من PBS الذي يحتوي على EDTA فوق البلازما المتبقية وجهاز الطرد المركزي الفائق عند 600،000 جم لمدة 2.5 ساعة عند أربع درجات مئوية. تخلص من 900 ميكرولتر من الطبقة العليا للتخلص من جزء البروتين الدهني منخفض الكثافة للغاية.

ثم أضف 540 ميكرولتر من 0.5 جرام لكل مليلتر من محلول بروميد البوتاسيوم إلى البلازما لضبط الكثافة على 1.063. امزج المحتويات برفق باستخدام ماصة وجهاز طرد مركزي فائق عند 600، 000 جم لمدة 2.5 ساعة عند أربع درجات مئوية. اجمع 540 ميكرولتر من الطبقة العليا التي تحتوي على بروتين دهني منخفض الكثافة.

انقل الجزء الذي تم جمعه إلى غشاء غسيل الكلى وقم بإزالة الكلى مقابل لترين من PBS يحتوي على EDTA عند أربع درجات مئوية في الظلام للتخلص من بروميد البوتاسيوم. أضف 152 ميكرولتر من 0.01٪ بوليسين ، أو محلول جيلاتين 0.1٪ إلى كل بئر من طبق مكون من 12 بئرا واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق على الأقل. ثم قم بإزالة المحلول من الآبار ، واغسله مرة واحدة ب 200 ميكرولتر من الماء المعقم ، واترك الآبار تجف تماما في درجة حرارة الغرفة.

قم بتخزين الطبق المحضر في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام مرة أخرى. قم بإعداد الألواح المطلية بالجيلاتين باتباع نفس الإجراء كما هو موضح للبوليلين. الثقافة مرتين في عشرة بقوة ست خلايا HL60 لكل 10 ملليلتر في وسط RPMI-1640 ، مكملة باثنين من حمض الريتينويك الميكرومولار العابر.

بعد أربعة أيام من الحضانة بحمض الريتينويك المتحولين بالكامل ، اجمع خلايا HL60. جهاز طرد مركزي للخلايا التي تم جمعها عند 220 جم لمدة أربع دقائق عند 18 إلى 22 درجة مئوية. استنشق المادة الطافية ، ثم اغسل الخلايا بحجم متساو من وسط RPMI-1640 الخالي من المصل.

قم بالطرد المركزي للخلايا المغسولة مرة أخرى عند 220 جم لمدة أربع دقائق عند 18 إلى 22 درجة مئوية وأعد تعليق الخلايا في وسط RPMI-1640 الخالي من المصل. بعد ضبط تركيز الخلية إلى مرتين في عشرة إلى قوة ست خلايا لكل مليلتر ، ضع 0.5 ملليلتر من المعلق في كل بئر من صفيحة مكونة من 12 بئرا مطلية مسبقا بالبولي ليسين. أضف 100 ميكرولتر من وسط RPMI-1640 الخالي من المصل مع أو بدون 300 نانومولار أو بوربول 12-ميريستات 13-أسيتات أو PMA.

زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط من الآبار. اغسل الخلايا مرة واحدة بوسيط RPMI-1640 الخالي من المصل واستبدله ب RPMI-1640 الخالي من المصل الذي يحتوي على صفر أو 20 ميكروغرام لكل مليلتر من البروتين الدهني منخفض الكثافة.

استمر في زراعة الخلايا لمدة ساعتين. اجمع وسط الاستزراع من كل بئر في أنبوب وجهاز طرد مركزي عند 700 جم لمدة ثلاث دقائق عند 18 إلى 22 درجة مئوية لإزالة الحطام الخلوي. للتحفيز ، احصل على مزرعة الخلايا البطانية الأبهرية البشرية واستبدل الوسط المستهلك ب 0.5 مل من وسط الاستزراع الطازج ، واحتضن الخلايا لمدة 30 دقيقة.

أخيرا ، أضف 167 ميكرولتر من وسط الاستزراع الذي تم جمعه من خلايا شبيهة بالعدلات تحتوي على مصائد العدلات خارج الخلية و LDL إلى أطباق الخلايا البطانية الأبهرية البشرية. أدى تحفيز الخلايا البطانية الأبهرية البشرية باستخدام مصائد العدلات خارج الخلية إلى تغيرات مورفولوجية تعتمد على الجرعة من شكل يشبه الحصى إلى شكل ممدود. تم تعزيز التغيرات المورفولوجية في الخلايا البطانية الأبهرية البشرية عند تحفيزها باستخدام مصائد العدلات خارج الخلية التي يسببها LDL ، مع استطالة مرئية واضحة في وقت مبكر يصل إلى ست ساعات.